Influence of elevated hydrostatic pressure on Müller cells phenotype. Do microglia-derived microvesicles play a role?

Abstract

O glaucoma é das principais causas de cegueira a nível mundial. Esta doença é caracterizada pela atrofia do nervo ótico e morte de células ganglionares da retina (CGR). A pressão intraocular (PIO) elevada é o principal fator de risco para o desenvolvimento e progressão desta doença. A neuroinflamação mediada pelas células da glia contribui para a neurodegeneração da retina no glaucoma. No entanto, os mecanismos que estão envolvidos neste processo ainda não foram clarificados. As microvesículas (MVs) são vesículas extracelulares (VE) formadas pela fissão para o exterior da membrana plasmática e estão envolvidas na comunicação celular. A contribuição das MVs derivadas de microglias para a inflamação da retina é desconhecida. Tendo em conta o envolvimento das células da microglia e das células de Müller no glaucoma, neste estudo, pretendeu-se investigar se as MVs derivadas das células da microglia interferem com as células de Müller e avaliar os efeitos das MVs nas células de Müller e na retina.As células da microglia (linha celular BV-2) foram expostas a pressão hidrostática elevada (PHE), mimetizando o aumento da PIO. As células da condição controlo foram incubadas a pressão atmosférica. As MVs provenientes de células BV-2 (MV-CT e MV-PHE) foram isoladas por ultracentrifugação de baixa velocidade e caracterizadas por análise de rastreamento de nanopartículas, microscopia eletrónica de transmissão e expressão de marcadores proteicos característicos de VE. As células de Müller (linha celular MIO-M1) foram incubadas com MV-CT ou MV-PHE e expostas a PHE ou pressão atmosférica. Em seguida, os efeitos da PHE e das MVs foram avaliados nas células MIO-M1. Para além disso, MVs foram injetadas no vítreo de murganhos C57BL/6J e os efeitos foram avaliados 24h e 7 dias após a injeção.As células MIO-M1 expostas a PHE e incubadas com MVs não apresentaram alterações que indiquem gliose. As células MIO-M1 sob PHE aumentaram a produção de fatores pró-inflamatórios e a expressão de quimiocinas, no entanto, as MVs derivadas de microglias induziram, de uma forma geral, a resposta oposta nas células MIO-M1. As células MIO-M1 têm uma resposta moderada à PHE e as MVs de microglias são capazes de influenciar a resposta das células de Müller, no entanto, são necessários mais estudos para explorar aprofundadamente estes efeitos.Após a administração intravítrea das MVs nos murganhos C57BL/6J, a análise por tomografia de coerência ótica mostrou que as MVs não alteraram significativamente a espessura da retina e observaram-se “spots” no vítreo, sugerindo a presença de células no vítreo, provavelmente células pertencentes ao sistema imunitário. A análise dos infiltrados vítreos revelou que estas células se encontram mais presentes 24h após a injeção de MV-PHE, comparando com o efeito das MV-CT. Sete dias após a injeção, ocorreu um decréscimo substancial na presença destas células no vítreo de animais em que MV-PHE foram administradas em comparação com a injeção de MV-CT. Os níveis das proteínas TSPO e iNOS aumentaram 24h após a exposição de MVs, sugerindo um aumento da inflamação. Imunohistoquímica revelou um aumento na imunomarcação de GFAP e no número de células MHC-II+/Iba1+, o que indica ativação das células de Müller e da microglia após a injeção de MVs. Além disso, as MVs induziram a morte de células da retina e a perda de CGR. De modo geral, as MVs derivadas de microglias induziram neuroinflamação da retina, gliose reativa e perda de CGR, mostrando que as MVs de origem microglial podem contribuir para a degeneração da retina. Curiosamente, ambas as populações de MVs causaram efeitos na retina, o que indica que estas conseguem disseminar o sinal inflamatório independentemente do estado de ativação das microglias. Em resumo, os resultados demonstraram que as microglias libertam MVs capazes de interagir com células de Müller e células da retina, modulando a sua resposta, o que segure que as MVs derivadas de microglias podem ser uma via de comunicação entre células gliais e propagar sinais inflamatórios na retina.

Glaucoma is a leading cause of blindness worldwide. This disease is characterized by optic nerve atrophy and retinal ganglion cell (RGC) death. Elevated intraocular pressure (IOP) is the main risk factor for the onset and progression of the disease. Neuroinflammation mediated by glial cells contributes to retinal neurodegeneration in glaucoma. However, the mechanisms that contribute to this process are not identified yet. Microvesicles (MVs) are extracellular vesicles (EV) formed by outward budding of the plasma membrane and are involved in cell-to-cell communication. The contribution of microglial MVs to retinal inflammation is unknown. Microglia and Müller cells play important roles in glaucoma, therefore, in this study, we aimed to explore if MVs derived from microglial cells communicate with Müller cells, and evaluate the effects of MVs on Müller cells and in the retina.Microglia cells (BV-2 cell line) were exposed to atmospheric and elevated hydrostatic pressure (EHP) to mimic elevated IOP. Control BV-2 cell cultures were maintained under atmospheric pressure conditions. MVs from BV-2 cells (MV-CT and MV-EHP) were isolated by low-speed ultracentrifugation and characterized by nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy, and expression of protein markers characteristic of EV. Müller cells (MIO-M1 cell line) were incubated with MV-CT or MV-EHP under EHP or atmospheric pressure. The effects of EHP and MVs on MIO-M1 cells were evaluated. Additionally, MVs were injected in the vitreous of C57BL/6J mice and 24h and 7 days post-injection the effects were evaluated.The results show that MIO-M1 cells, exposed to EHP and incubated with MVs, did not express Müller cells gliotic markers. MIO-M1 cells under EHP increased pro-inflammatory factor production and upregulated chemokine expression, while, in general terms, MVs from microglial cells induced the opposite response in MIO-M1 cells. The results show that MIO-M1 cells have a mild response to EHP and that microglial MVs can influence Müller cells response, however, more studies are necessary to further explore these results.After administration of MVs into the vitreous of C57BL/6J mice, optical coherence tomography (OCT) showed that MVs do not significantly change retinal thickness. However, “spots” were observed in the vitreous, suggesting the presence of cells in the vitreous, likely corresponding to immune cells. The densitometric analysis of the cell infiltrates showed that eyes injected with MV-EHP presented more cells in the vitreous cavity 24h after injection compared with MV-CT. After 7 days post-injection, there was a significant decrease in cells infiltrates in MV-EHP condition when compared with MV-CT. TSPO and iNOS protein levels increased 24h after MVs exposure, suggesting an increase in inflammation. Immunohistochemistry revealed an increase in GFAP staining and the number of MHC-II+/Iba1+ cells in retinas, indicating Müller cell and microglia activation after MVs injection. Moreover, MVs induced retinal cell death and decreased RGC survival. Overall, microglia-derived MVs induced retinal neuroinflammation, reactive gliosis, and RGC loss, showing that MVs derived from microglia may contribute to retinal degeneration. Both populations of MVs affect the retina, suggesting that microglial-derived MVs propagate the inflammatory signal, independently from the microglial cells state of activation.In summary, the results demonstrated that microglia release MVs that are able to interact with Müller cells and retinal cells, modulating their response, suggesting that MVs derived from microglial cells could be a via of communication between glial cells and propagate inflammatory signals in the retina.