Explore the role of parkin in endoplasmic reticulum stress and ER-associated protein degradation : cellular models for juvenile PD

Abstract

A doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e é caracterizada principalmente por disfunção motora, como resultado da perda selectiva de neurónios dopaminérgicos. A doença de Parkinson Juvenil de transmissão Autossómica Recessiva (ARJP) é uma forma genética rara, apresentando sintomas semelhantes à DP idiopática, embora seja caracterizada por uma idade de início jovem (normalmente antes dos 40). Esta doença é causada por mutações no gene PARK2 que codifica a parkina, uma E3-ubiquitina ligase. A resposta a proteínas unfolded (UPR) leva à activação de três vias celulares protectoras, necessárias para a célula lidar com as situações de stress e resulta no aumento da expressão de genes de stress do Retículo Endoplasmático (RE). Dados recentes reforçam a existência de uma maquinaria de suporte, que liga os substratos ubiquitinados da membrana do RE ao proteossoma, num processo conhecido como degradação de proteínas associadas ao RE (ERAD). Além disso, foi demonstrado que as proteínas misfolded e os agregados são capazes de induzir uma resposta de stress do RE, provavelmente devido à supressão da função do proteossoma, um componente essencial da maquinaria da ERAD. O nosso objectivo era esclarecer o papel de diferentes mecanismos de resposta celular na formação e na limpeza de agregados de parkina, incluindo a resposta de stress do RE e a ERAD. Para isso, estudamos nove mutações que cobrem todos os domínios da proteína parkina. Primeiro, foi avaliado o papel da ERAD na limpeza da parkina normal e mutada, através da potenciação ou supressão da ERAD nos diferentes modelos celulares. Em seguida, foram explorados os efeitos de diferentes mutantes da parkina no stress do RE, de modo a avaliar os níveis de proteínas relacionadas com a UPR nestes modelos celulares. Os nossos dados mostram que a VCP pode ter um papel na limpeza de agregados de parkina e que a sua sobrexpressão pode resultar no aumento dos níveis de expressão da parkina. Por outro lado, os nossos dados não suportam a activação da UPR na presença dos diferentes mutantes de parkina. Além disso, observou-se também um aumento na expressão das chaperones moleculares do RE nas células que co-expressam a parkina e VCP WT ou DN. Em conclusão, os nossos resultados sugerem que mutações no gene PARK2 podem levar ao misfolding da parkina, contribuindo para a formação de agregados, que co-localizam com a VCP. Com este trabalho, conseguimos obter mais dados que relacionam a parkina com o RE e em particular com a ERAD, reforçando a hipótese de que a modulação da VCP e da actividade da ERAD pode ter um potencial terapêutico significativo na ARJP.

Parkinson disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder and is mainly characterized by motor dysfunction, as the result of selective loss of dopaminergic neurons. Autosomal Recessive-Juvenile Parkinson’s disease (AR-JP) is a rare genetic form, showing symptoms resembling idiopathic PD, although being characterized by a young age-at-onset (usually under 40). This disorder is caused by mutations in the PARK2 gene which encodes parkin, an E3-ubiquitin ligase. The unfolded protein response (UPR), leading to the activation of three protective cellular pathways, is required for the cells to cope with stressful conditions and results in the upregulation of endoplasmic reticulum (ER) stress genes. Recent observations support the existence of escorting machinery, which connects the ubiquitinated substrates at the ER-membrane with the proteasome, in a process known as ER-associated degradation (ERAD). Also, it has been shown that misfolded proteins and aggregates are able to induce ER stress, probably by suppressing proteasome function, an essential component of the ERAD machinery. Our aim was to clarify the role of different cellular response mechanisms in the formation and clearance of parkin aggregates, including the endoplasmic reticulum stress response and ERAD. To accomplish this we studied nine mutations covering all parkin domains. First, we evaluated the role of ERAD in wild-type and mutant parkin clearance, by potentiating or suppressing ERAD in the different cellular models. Then, we explored the effect of the different parkin mutants on ER stress by assessing the levels of UPR-related proteins in these cellular models. Our data show that VCP may have a role in the clearance of parkin aggregates and that VCP overexpression may result in an increase in parkin expression levels. Moreover, our data do not support the activation of an UPR in the presence of the different parkin mutants. Also, we observed a striking increase in the expression of ER molecular chaperones in cells co-expressing parkin and WT or DN VCP. In conclusion, our results suggest that mutations in PARK2 lead to parkin misfolding, contributing to the formation of aggregates that co-localize with VCP. With this work we enlarge the amount of data relating parkin with the ER and in particular with ERAD, raising the possibility that modulation of VCP and ERAD activity might have potential therapeutic significance for AR-PD.