Auto-fluorescência em processos de agregação de péptidos e proteínas: beta-amilóide na presença de iões e lisozima sob condições promotoras de agregação

Abstract

O estudo do mecanismo de formação de agregados proteicos é atualmente alvo de interesse devido à sua frequente relação com doenças neurológicas como o Alzheimer, mas também devido às suas características estruturais e mecânicas relevantes para aplicação em diversas áreas. Devido ao facto da mesma proteína poder dar origem a diferentes tipos de agregados dependendo do meio em que se encontra inserida, é necessário perceber a influência dos vários fatores na formação destes e o seu mecanismo de formação. Visando estes objetivos, neste trabalho, foi usado um péptido e uma proteína, nomeadamente o péptido β-amilóide (Aβ), para estudar a formação de agregados proteicos na presença de iões metálicos, e a lisozima da clara do ovo de galinha (HEWL), bem caracterizada na literatura como modelo para o estudo de formação de fibrilas amilóides e agregados amorfos. Os iões metálicos, nomeadamente zinco, cobre e ferro foram estudados como indutores da agregação in vitro sob condições controladas. A formação de agregados foi avaliada laboratorialmente por técnicas de microscopia, em conjunto com espetroscopia de fluorescência que permitiram estudar a estabilidade, cinética, extensão e o tipo de agregados proteicos formados. Verificou-se a formação de fibrilas de Aβ com características amilóides na presença de cobre e ferro a 12.5 µM, tendo sido também verificada a formação de agregados com estrutura amorfa, ao fim de 30h de incubação. Os restantes agregados na presença de zinco, visualizados por microscopia apresentaram morfologia amilóide na ausência deste ião e na maior concentração deste, 125 µM. No caso da estabilidade das fibrilas por espetroscopia de fluorescência verificou-se a estabilização da estrutura a partir das 23h/24h. Para a HEWL verificou-se a formação de fibrilas com características amilóides na presença do tampão Glicina-HCl a pH 2 com uma temperatura de 60⁰C, 2M ureia a pH 7.5 e 200 µM SDS a pH 9. A formação de fragmentos com características não amilóides verificou-se na presença de 90% etanol a pH 7.5, 2 mM DTT a pH 7.5 e 10 mM TCEP em tampão HEPES.A partir dos resultados de auto-fluorescência, é possível afirmar que estes permitiram deduzir qual o tipo de agregado, uma vez que na presença de agregados amilóides houve evidência de uma nova banda a aproximadamente 460 nm.

The study of the mechanism of formation of protein aggregates is of high interest due to its frequent relationship with neurological diseases such as Alzheimer's, but also due to their structural and mechanical characteristics relevant for application in several areas. Since the same protein can give rise to different types of aggregates, depending on the medium in which it is inserted, it is necessary to perceive the influence of the various factors in the formation of these and their mechanisms of formation. Envisioning these objectives, in this work, a peptide and a protein, namely the β-amyloid peptide (Aβ), was used to study the formation of protein aggregates in the presence of metal ions, and hen egg white lysozyme (HEWL), well characterized in the literature as a model for the study of the formation of amyloid fibrils and amorphous aggregates. Metal ions, namely zinc, copper and iron, were studied as inducers of aggregation in vitro under controlled conditions. Aggregate formation was evaluated by laboratory microscopy techniques, together with fluorescence spectroscopy, which allowed the study of stability, kinetics, extension and type of protein aggregates formed. The formation of Aβ fibrils with amyloid characteristics was verified in the presence of copper and iron at 12.5 µM, and the formation of aggregates with amorphous structure was also verified, after 30h of incubation. The remaining aggregates in the presence of zinc, visualized by microscopy, showed amyloid morphology in the absence of this ion and at its highest concentration, 125 µM. In the case of fibril stability by fluorescence spectroscopy, the stabilization of the structure was verified from 23h/24h. For HEWL, the formation of fibrils with amyloid characteristics was verified in the presence of Glycine-HCl buffer at pH 2 with a temperature of 60⁰C, 2M urea at pH 7.5 and 200 µM SDS at pH 9. The formation of fragments with non-amyloid characteristics it was found in the presence of 90% ethanol at pH 7.5, 2 mM DTT at pH 7.5 and 10 mM TCEP in HEPES buffer.From the auto-fluorescence results, it is possible to state that these allowed the deduction of the type of aggregate, since in the presence of amyloid aggregates there was evidence of a new band at approximately 460 nm.