Development of Device Control and Real-Time Data Analysis Methods for a Nonlinear Multiphoton Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy (MP-FLIM) System

Abstract

Nos últimos anos, a microscopia multifotónica emergiu como uma prolixa área de investigação e como uma ferramenta pré-clínica para observação detalhada do comportamento celular e metabólico. A microscopia multifotónica permite imagens profundas, devido à sua capacidade de penetrar nos tecidos ao mesmo tempo que induz reduzida fototoxicidade. Isto torna a microscopia multifotónica adequada para observações a longo prazo em tecidos vivos.O microscópio multifotónico pode ser aplicado em células sem rótulo com componentes fluorescentes naturais ou aplicado em células com fluoróforos administrados. Cada fluoróforo é excitado pela luz com uma gama específica de comprimentos de onda.Recentemente, as vantagens dos lasers de ultra-banda de poucos ciclos promoveram o desenvolvimento da tecnologia SyncRGB-FLIM. Esta tecnologia incorpora um procedimento de imagem integrado e é muito eficiente na distinção de diferentes áreas pela sua distribuição de fluorescência durante a sua vida útil. Esta tese descreve o desenvolvimento de software dedicado de controlo de dispositivos e análise de dados que permite o uso do microscópio SyncRGB-FLIM. O controlo de dispositivos e análise de dados permite a criação de imagens em tempo real de células rotuladas com um máximo de três fluoróforos.O software foi testado em laboratório, onde os primeiros dados de imagem foram recolhidos e analisados em amostras celulares manchadas de várias cores em tempo real. Demonstra-se que dois ou mais cromóforos podem ser distinguidos apenas pela sua fluorescência, utilizando apenas um único detetor.

Over the past years, multiphoton microscopy has emerged as a powerful research stream and pre-clinical tool for observing detailed cellular and metabolic behaviour. Multiphoton microscopy allows deep imaging, due to its ability to penetrate tissues while inducing reduced phototoxicity. This makes multiphoton microscopy suitable for long-term observations in living tissues.Multiphoton microscopy can be applied to label-free cells with natural fluorescent components or applied in cells with administrated fluorophores. Each fluorophore is excited by a specific wavelength range.Recently, advantages in ultrabroadband few-cycle lasers have promoted the development of SyncRGB-FLIM technology. This technology has an integrated imaging procedure and takes advantage on distinguishing different areas by their fluorescence lifetime distribution. This is possible due to the broad spectral profile of the few-cycle lasers, exciting fluorophores with different wavelength excitation ranges.This thesis describes the development of dedicated device control and data analysis software that enables the use of SyncRGB-FLIM microscopy. The device control and data analysis allow the creation of real-time imaging of cells labelled with up to three fluorophores.The software was tested in the laboratory, where first image data was collected and analyzed on multi colour-stained cellular samples in real-time. It is shown that two or more chromophores can be distinguished merely by their fluorescence using just a single detector.