Can the extracellular vesicles released by Müller glial cells provide neuroprotection to retinal ganglion cells?

Abstract

Extracellular vesicles (EVs) play an important role in intercellular communication and include exosomes (EXOs), microvesicles (MVs) and apoptotic bodies. EVs are produced by many cell types. Glaucoma is an optic neuropathy, characterized by retinal ganglion cell (RGC) loss and degeneration of optic nerve (RGC axons) that leads to loss of visual fields, culminating in blindness. The current therapeutics are focused in lowering intraocular pressure (IOP), the main risk factor, but the disease progresses in a large number of patients. Therefore, novel and effective therapeutic strategies targeting RGC neuroprotection are needed to halt disease progression. Müller cells, the main glial cell type of the retina, have important functions in the regulation of homeostasis of the retina. Müller cells have the ability to protect RGCs either by physical contact or by secreted factors. A previous study demonstrated that Müller cells release EVs. Due to the neuroprotective properties of Müller cells, this study aimed to elucidate the role of the conditioned medium (CM) and MVs from Müller cells in the survival of RGCs in the context of elevated pressure. Primary cultures of Müller cells and RGCs and cultures of MIO-M1 cells were exposed to elevated hydrostatic pressure (EHP) to mimic the elevated IOP. Primary Müller cellcultures and MIO-M1 cell line were incubated in atmospheric (control) pressure andCM were collected. The effect of CM in cell survival was assessed incubating primaryRGC cultures and co-cultures of RGCs and Müller cells exposed to EHP with CM. MVs from MIO-M1 cells (MVs MIO-M1) and from primary Müller cells (MVs Müller) were isolated by low-speed ultracentrifugation and characterized in size, morphology and concentration by nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy, and by the presence of proteins by Western Blot. MIO-M1 cultures and primary cultures of RGCs were incubated under EHP with MVs and cell survival was analysed. Additionally, the effect of MVs MIO-M1 in the retina were determined 7 days after intravitreal injection of MVs MIO-M1. Under EHP conditions, RGCs had a significant decrease in cell survival at 24h in pure RGC cultures. The exposure of Müller cells to EHP for 48h and 72h significantly decreased cell survival. However, when in co-culture, RGCs only presented a significant decrease in cell survival at 72h under EHP and Müller cells showed a tendency to a decrease in cell survival at 72h under EHP. MIO-M1 cells survival was not affected by exposure to EHP for 24h or 48h. The exposure of primary Müller cells or MIO-M1 cells to EHP did not cause alterations in cell proliferation. CM from both Müller cell cultures promoted the survival of RGC cultures exposed to EHP. In co-cultures, this effect was not so pronounced. MVs MIO-M1 increased RGC survival and did not affect MIO-M1 cells proliferation in EHP conditions. The results showed that both CMs and MVs MIO-M1 could increase RGCs survival in vitro. Additionally, we observed that the intravitreal injection of phosphate-buffered saline(PBS) 1h before I-R caused alterations in the retinal structure, an effect apparently caused by the synergistic action of I-R injury and PBS. The contralateral eyes of the I-R eyes did not present changes in retinal structure. Therefore, we evaluated the effect of intravitreal injection of MVs MIO-M1 only in contralateral retinas. The intravitrealinjection of MVs MIO-M1 or PBS did not seem to change retinal function or structure.However, by optical coherence tomography bright spots were observed in the vitreous, suggesting the presence of cells infiltrates. Seven days after injection, retinal cell death, RGCs survival, number of microglia, reactive microglia and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity were assessed. Intravitreal injection of MVs MIO-M1 increased the reactivity of Müller cells and microglia, but did not change cell death or the number of RGCs.In summary, the results demonstrate that CM from different types of Müller cells can protect RGCs exposed to EHP. Also, Müller cells release MVs that promote the survival of RGCs. Moreover, MVs from MIO-M1 cells do not cause alterations in the structure and function of the retina, but cause glial reactivity. Further experiments are needed to understand the protective properties of MVs from Müller cells in the context of glaucoma neuroprotection.

As vesículas extracelulares têm um papel importante na comunicação intercelular e incluem exosomas, microvesículas e corpos apoptóticos. As vesículas extracelulares são produzidas por vários tipos de células.O glaucoma é uma neuropatia ótica caracterizada pela perda de células ganglionares da retina (CGRs) e degeneração do nervo ótico (axónios das CGRs) que origina a perda de campos visuais, culminando eventualmente em cegueira. A terapêutica atual foca-se na redução da pressão intraocular, o principal fator de risco, mas a doença progride em muitos doentes. Desta forma, novas abordagens terapêuticas direcionadas à proteção das CGRs são necessárias para abrandar a progressão da doença. As células de Müller são as principais células da glia da retina e desempenham funções importantes na regulação da homeostasia. Estas células participam na proteçãodas CGRs, seja por contacto físico seja através de fatores libertados. Um estudo anterior demonstrou que as células de Müller libertam vesículas extracelulares. Devido às propriedades neuroprotetoras das células de Müller, este trabalho pretendeu elucidar opapel do meio condicionado e das microvesículas libertadas pelas células de Müller na sobrevivência das CGRs num contexto de pressão elevada. Culturas primárias de células de Müller e de CGRs, e células MIO-M1 (linha celular)foram expostas a pressão hidrostática elevada (PHE), para mimetizar o aumento da pressão intraocular. Culturas primárias de células de Müller e culturas de células MIO-M1foram incubadas à pressão atmosférica (controlo) para recolha do meio condicionado. O efeito dos meios condicionados na sobrevivência celular foi observado incubando culturas primárias de CGRs e co-culturas de CGRs e células de Müller expostas a PHEcom os meios condicionados. As microvesículas derivadas de células MIO-M1 (MVsMIO-M1) e de células de Müller primárias foram isoladas por ultracentrifugação de baixa velocidade e caracterizadas em tamanho, morfologia e concentração por análise de rastreio de nanopartículas, microscopia eletrónica de transmissão e pela presença de proteínas por Western Blot. As culturas de células MIO-M1 e as culturas primárias de CGRs foram incubadas sob PHE com microvesículas, e a sobrevivência celular foi analisada. Adicionalmente, os efeitos das MVs MIO-M1 na retina foram avaliados 7dias após a injeção no vítreo de ratos Wistar Han. Em condições de PHE observou-se uma diminuição da sobrevivência das CGRs após24h, em culturas primárias de CGRs. A sobrevivência das células de Müller em culturas primárias diminuiu significativamente quando as células foram expostas a PHE durante48h e 72h. Contudo, quando em co-cultura, as CGRs apresentaram uma diminuição significativa da sua sobrevivência apenas às 72h sob PHE e a sobrevivência das células de Müller foi afetada apenas às 72h de exposição. A sobrevivência de células MIO-M1não foi afetada pela exposição a PHE nos tempos avaliados. A exposição das célulasde Müller primárias ou das células MIO-M1 a PHE não alterou a proliferação celular.18Ambos os meios condicionados promoveram a sobrevivência de CGRs quando expostas a PHE. Em co-culturas este efeito não foi tão pronunciado. MVs MIO-M1 aumentaram a sobrevivência das CGRs e não afetaram a proliferação de células MIO-M1 sob PHE. Os resultados revelaram que ambos os meios condicionados e que MVs MIO-M1promoveram a sobrevivência de CGRs in vitro.A injeção intravítrea de solução tampão fosfato-salino (PBS, do inglês Phosphate buffered saline) 1h antes da indução da isquémia e reperfusão da retina causou alterações estruturais na mesma, um efeito aparentemente causado pela ação sinergística do insulto e do PBS. Os olhos contralaterais não apresentaram alterações na estruturada retina. Portanto, avaliou-se o efeito da injeção intravítrea das MVs MIO-M1 em retinas contralaterais. A injeção intravítrea de MVs MIO-M1 ou PBS não evidenciaram alterações na função ou estrutura da retina. Contudo, por tomografia de coerência ótica foram observados pontos brilhantes no vítreo, sugerindo a presença de células. Sete dias após a injeção, avaliou-se o efeito das MVs MIO-M1 na morte celular da retina, sobrevivência das CGRs, número de células da microglia e de microglia reativa e imunorreatividade de GFAP. A injeção intravítrea de MVs MIO-M1 aumentou a reatividade de células de Müller e da microglia, sem alterações significativas na mortecelular e sobrevivência das CGR. Resumindo, os resultados demonstram que o meio condicionado de diferentes tiposde células de Müller protegem CGRs expostas a PHE. As células de Müller libertam microvesículas que promovem a sobrevivência de CGRs. Além disso, MVs MIO-M1não causam alterações na estrutura e função da retina, mas aumentam a reatividade das células da glia. Mais experiências são necessárias para compreender melhor as propriedades das MVs derivadas de células de Müller num contexto de neuroproteção em glaucoma.