Morphological and physiological evaluation of tamarillo (Solanum betaceum Cav.) somatic embryogenesis-derived plants

Abstract

A embriogénese somática (ES) é uma ferramenta eficaz para clonagem e micropropagação em larga escala para muitas espécies. No tamarilho (Solanum betaceum Cav.) a clonagem por embriogénese somática está bem estabelecida e ocorre através de um protocolo bifaseado. A primeira fase passa pela formação de um calo embriogénico através da indução de segmentos de folhas jovens ou embriões zigóticos em meio rico em auxina (2,4-D ou Picloram), suplementado com uma elevada concentração de sacarose (0,3 M). Este calo pode ser mantido nesse mesmo meio por 4-5 semanas, sem perda da sua capacidade embriogénica durante subculturas sucessivas. Depois da sua transferência para um meio sem auxina e com uma quantidade de sacarose mais reduzida (0,1 M), o calo embriogénico desenvolve-se em embriões somáticos que se convertem em plantas. Algumas desvantagens deste processo são anomalias dos embriões e restrições no seu desenvolvimento e conversão. Realizaram-se diversos ensaios para otimizar o desenvolvimento de embriões e regeneração de plantas.Diferentes linhas de calo embriogénico (EC1, EC2, EC3) derivadas de indução de ES em folhas com tempos diferentes em cultura (1 a 5 anos) foram sujeitas a 3 tratamentos distintos: 1) 0,05 µM tricostatina A durante 2 dias; 2) 20,0 µM 5-azacitidina durante 2 dias; 3) imersão em 0,2% (w/v) de carvão ativado. Na linha EC2 o tratamento com carvão ativado levou a um maior número de embriões por 100 mg de calo (≈ 74,3). No entanto, a conversão ocorreu apenas nos tratamentos com tricostatina A e 5-azacitidina com taxas mais altas para a linha EC1 (10,0% e 5,17%, respetivamente). A taxa de sobrevivência de plantas mais elevada foi obtida em plântulas provenientes do tratamento com tricostatina A. Para avaliar a qualidade dos embriões realizaram-se análises de microscopia eletrónica de varrimento e de expressão de genes. Plantas aclimatizadas provenientes de calo submetidos aos diferentes tratamentos foram comparadas com plantas provenientes de calo sem tratamento e com plantas provenientes de sementes, através de parâmetros de crescimento, de trocas gasosas e fotossintéticos. Os resultados demonstraram que as plântulas obtidas por embriogénese somática têm um desenvolvimento semelhante àquelas obtidas por semente.

Somatic embryogenesis (SE) is an effective tool for cloning and large-scale propagation as shown for many species, including many trees. In the solanaceous tree tamarillo (Solanum betaceum Cav.) plant cloning through SE is based on a well-established protocol involving two steps. In the first one, embryogenic calli is formed by induction from young leaf segments or mature zygotic embryos in an auxin-containing medium (2,4-D or Picloram) supplemented with high sucrose levels (0.3 M). These calli can be kept in the same medium for 4-5 week, maintaining their embryogenic potential throughout successive subcultures. Following transfer to an auxin-free medium containing lower sucrose levels (0.1 M), embryogenic calli evolve into somatic embryos that convert and produce plants. Main drawbacks of this system are the high frequency of abnormal embryos as well as arrested somatic embryo development and conversion. To optimize somatic embryo development and plant regeneration several experiments were carried out.Different embryogenic lines (EC1, EC2, EC3) derived from SE leaf induction with different times of culture (1 to 5 years) were subjected to 3 different treatments: 1) 0.05 µM trichostatin A for 2 days; 2) 20.0 µM 5-azacycitide for 2 days and 3) a rinse with 0.2 % (w/v) activated charcoal, before transference to auxin-free conversion media. Activated charcoal treatment led to a higher number of somatic embryos reaching ≈74.3 embryos per 100mg of calli in the line EC2, but only the trichostatin A and the 5-azacitidine treatments allowed the efficient conversion of somatic embryos into plantlets in the line EC1 (10.0% and 5.17%, respectively). Survival rates were higher for plantlets resulting from the trichostatin A treatment. Scanning electron microscopy and gene expression analysis were made to evaluate embryo quality. Successfully acclimatized plantlets from calli previously subjected to the different treatments were compared with plants from non-treated calli and with plants from zygotic origin, through growth, gas-exchange and photosynthetic parameters. Results show that SE-derived plants have a similar development to seed-derived plants.