Towards a better understanding of host cell requirements for Salmonella cytosolic replication

Abstract

Salmonella enterica é uma bactéria gram-negativa e intracelular facultativa, adquirida através de comida e água contaminadas, que infecta humanos e outros animais causando infeções gastrointestinais. Salmonella pode invadir células fagocíticas e não fagocíticas, como células epiteliais e fibroblastos. Esta bactéria usa dois sistemas de secreção do tipo 3 para entregar proteínas efetoras na célula hospedeira para regular o processo de invasão de células não fagocíticas e a vida intracelular da bactéria. Após a invasão, a Salmonella pode permanecer dentro do vacúolo, onde pode replicar, ou pode escapar para o citosol. No citosol, as bactérias estão suscetíveis às respostas do hospedeiro, como a ativação do inflamassoma e da via da autofagia, que permitem ao hospedeiro controlar a replicação e a sobrevivência da Salmonella. No entanto, Salmonella citosólica também tem a vantagem de maior acessibilidade a nutrientes e portanto, se escapar às defesas, pode híper-replicar. Essencialmente, os fatores/vias do hospedeiro necessários para a replicação citosólica da Salmonella continuam pouco entendidos. MicroRNAs são pequenos RNAs não codificadores com 18-25 nucleótidos, que regulam a pós-transcrição do mRNA. Já foi mostrado que infeções bacterianas levam a alterações na expressão de microRNAs que afetam muitos processos, entre eles resposta imune, autofagia, ciclo celular, morte celular, que podem ter um efeito benéfico para o hospedeiro ou para a infeção bacteriana. Previamente, o laboratório identificou 6 microRNAs (incluindo dois da mesma família) que aumentam significativamente a replicação citosólica da Salmonella. Os objetivos do presente projeto eram expandir o conhecimento sobre a híper-replicação da Salmonella em diferentes células epiteliais, bem como perceber como é que a manipulação do hospedeiro por microRNAs influencia este fenótipo. Os resultados obtidos mostram que os níveis de híper-replicação são dependentes do hospedeiro e que certas células epiteliais, como HeLa 229, são menos permissivas a esta replicação. A coinfecção com Salmonella e Shigella em células HeLa 229 resulta num aumento de híper-replicação da Salmonella, o que indica que a Shigella é capaz de manipular o hospedeiro de modo a que a Salmonella possa replicar no citosol. Relativamente aos microRNAs, 3 dos 5 microRNAs testados resultam num aumento significativo da híper-replicação de Salmonella nas três linhas celulares epiteliais testadas. Adicionalmente os 5 microRNAs conduzem a aumento da híper-replicação com Salmonella D23580, semelhante aos resultados obtidos com Salmonella SL1344. A Salmonella D23580 é uma estirpe invasiva de Salmonella Typhimurium que pode frequentemente causar bacteriemia, contrariamente à Salmonella SL1344 que normalmente causa gastroenterites. Finalmente, os resultados obtidos sugerem um papel da autofagia na regulação da híper-replicação da Salmonella. Os resultados obtidos indicam níveis mais elevados de autofagia nas células HeLa 229 comparados com as células HeLa CCL-2, podendo potencialmente explicar a baixa híper-replicação em células HeLa 229. Adicionalmente, níveis mais baixos de autofagia promovidos pelo miR-5692a podem explicar o aumento da híper-replicação em células tratadas com este microRNA. No geral, os nossos resultados expandem o conhecimento sobre a híper-replicação da Salmonella, e proporcionam a base para identificação dos fatores do hospedeiro que regulam este fenótipo.

Salmonella enterica is a Gram-negative and facultative intracellular bacterium, acquired from contaminated food or water, which infects humans and other animals causing gastrointestinal infections. Salmonella can invade phagocytic cells and non-phagocytic cells, such as epithelial cells and fibroblasts. This bacteria uses two type-3 secretion systems to secrete effector proteins into the host cell to regulate the process of invasion of non-phagocytic cells and the intracellular life of the bacterium. Following invasion, Salmonella can remain inside a Salmonella-containing vacuole, where it can replicate, or it can escape to the cytosol. In the cytosol, the bacteria is susceptible to the host responses, such as the activation of the inflammasome and the autophagy pathway, which allow the host to control Salmonella replication and survival. However, cytosolic Salmonella also has the advantage of more accessibility to nutrients, so if it escapes from the host defenses it can hyper-replicate. Importantly, the regulation and the host factors required for the cytosolic replication are still poorly understood. MicroRNAs are small non-coding RNAs with 18-25 nucleotides that post-transcriptionally regulate mRNA targets. It has been shown that bacterial infection leads to changes in microRNA expression that affect many processes, including immune response, autophagy, cell cycle, cell death, which can be beneficial for the host or for the bacterial infection. Previously, our group identified 6 microRNAs (including two of the same family) that increase significantly the cytosolic replication of Salmonella. The aims of this project were to expand our knowledge on how the cytosolic replication of Salmonella varies among various epithelial cells and how the manipulation of the host by microRNAs influences the hyper-replication. The results show that the hyper-replication is dependent on the host and that there are epithelial cell lines, such as HeLa 229 cells, which are significantly less permissive to this lifestyle. We also show that the co-infection with Salmonella and Shigella of HeLa 229 cells increases the Salmonella hyper-replication, indicating that Shigella is able to manipulate the host in a way that allows Salmonella to replicate in the cytosol. Furthermore, 3 of the 5 microRNAs tested result in a significant increase of the Salmonella hyper-replication in the three epithelial cell lines tested. Additionally, the 5 microRNAs tested lead to an increase of the hyper-replication of Salmonella D23580, similar to what was observed for Salmonella SL1344. Salmonella D23580 is an invasive strain of Salmonella Typhimurium which can frequently cause bacteremia, contrary to Salmonella SL1344 that usually results in milder infections. Finally, the results also indicate a potential role for autophagy in the regulation of hyper-replication. The results indicate that autophagy levels are higher in HeLa 229 compared to HeLa CCL-2 cells, potentially explaining the lower Salmonella hyper-replication observed in HeLa 229 cells. Additionally, lower levels of autophagy elicited by miR-5692a may also explain the Salmonella hyper-replication increase observed in cells treated with this microRNA. Overall, our results expand the current knowledge about Salmonella hyper-replication, and provide the basis for the identification of host factors that regulate this phenotype.