Characterisation of the cytokinin-mediated biocontrol activity of Chlamydomonas reinhardtii against Pseudomonas syringae in tobacco and analysis of its potential as a bio-stimulant

Abstract

As microalgas são um grupo grande e diversificado de microrganismos que desempenham um papel importante na agricultura onde são utilizadas como biofertilizantes. Estudos anteriores demonstraram que as microalgas têm diversos efeitos sobre as plantas, como a indução de uma germinação mais rápida, promoção do crescimento de folhas e raízes e indução da resistência a organismos patogénicos quando aplicadas no solo. As microalgas também têm a capacidade de produzir fitohormonas incluindo auxina, ácido abscísico (ABA), citocinina (CK), etileno (ET) e giberelinas (GAs).As CK são uma classe bem conhecida de fitohormonas que desempenham um papel importante em várias funções das plantas ao longo da vida. Estes incluem o crescimento da raiz ou do rebento, a divisão celular e a senescência. Além disso, estudos recentes demonstram que as CKs também desempenham um papel significativo na defesa das plantas tendo sido registado um claro aumento das defesas contra bactérias patogénicas induzidas por microrganismos produtores de CK. De facto, foi relatado que o pré-tratamento de plantas com CKs produzidas pela estirpe G20-18 de Pseudomonas fluorescens mitigou a infeção por bactérias patogénicas.O objectivo geral deste estudo foi investigar se a estirpe da microalga Chlamydomonas reinhardtii, produtora de CKs, poderia promover a resistência à bactéria patogénica Pseudomonas syringae em Nicotiana tabacum. Em paralelo, testou-se ainda se a mesma microalga poderia atuar como bioestimulante nutras espécies vegetais. Para atingir estes objetivos foram realizadas várias experiências em que se utilizaram duas estirpes selvagens e seis estirpes mutantes de C. reinhardtii (knockouts dos genes que codificam a LOG e HMBPP redutase envolvidos na produção e sinalização de CK). Os resultados obtidos evidenciaram uma forte promoção da resistência de N. tabacum ao agente patogénico após infiltração com estirpes selvagens de C. reinhardtii. Por outro lado, as estirpes mutantes deficientes na produção e sinalização de CKs evidenciaram uma redução na promoção dessa resistência. Estes resultados comprovam que as CKs são uma parte essencial da capacidade que as microalgas têm de promover a resistência a agentes patogénicos. Em paralelo, demonstrou-se ainda que estirpes produtoras de CKs promovem o crescimento de plantas de tomateiro, tabaco e Arabidopsis suportando o seu papel como bioestimulante. Por fim, obtiveram-se evidências de que estas estirpes também podem estar envolvidas na indução da tolerância à seca em Arabidopsis. A utilização em paralelo neste trabalho de estirpes de C. reinhardtii produtoras de CKs e estirpes mutantes incapazes da sua produção, permitiu concluir que a capacidade de biocontrolo, bioestimulante e tolerância à seca induzida pelas estirpes selvagens se deva à produção de CKs. Estes resultados constituem uma evidência preliminar de que a microalga C. reinhardtii pode constituir um potencial concorrente aos fertilizantes e produtos utilizados na agricultura convencional, e que num futuro próximo pode ser utilizada como uma solução sustentável na bio-fertilização e biocontrol.

Microalgae are a large and diverse group of microorganisms that play an important role in agriculture where they are used as bio-fertilisers. Previous studies have shown that microalgae have several effects on plants, such as inducing faster germination, promoting leaf and root growth and inducing resistance to pathogens when applied to soil. Microalgae also have the ability to produce phytohormones including auxin, abscisic acid (ABA), cytokinin (CK), ethylene (ET) and gibberellins (GAs).CKs are a well-known class of phytohormones that play an important role in various plant functions throughout life. These include root or shoot growth, cell division and senescence. In addition, there is evidence that CKs also play a significant role in plant defence. This evidence comes from recent studies in which there is a clear increase in defences against pathogenic bacteria induced by CK-producing microorganisms. In fact, it has been reported that pre-treatment with CKs produced by Pseudomonas fluorescens strain G20-18 has mitigated infection by pathogenic bacteria in plants.The overall objective of this study was to investigate whether a CK-producing strain of the microalgae Chlamydomonas reinhardtii could promote resistance to the pathogenic bacterium Pseudomonas syringae in Nicotiana tabacum. In parallel, it was also tested whether the same microalgae could act as a bio-stimulant for other plant species. To achieve these goals, several experiments were carried out using two wild type strains and six mutant strains of C. reinhardtii (knockouts of genes coding for LOG and HMBPP reductase involved in the production and signalling of CK). The results showed a strong promotion of N. tabacum resistance to the pathogen after infiltration with the wild type strains of C. reinhardtii. On the other hand, mutant strains deficient in the production and signalling of CKs showed a reduction in the promotion of this resistance. These results prove that CKs are an essential part of the ability of microalgae to promote resistance to pathogens. Furthermore, the results obtained also showed that CK producing strains promote the growth of tomato, tobacco and Arabidopsis plants - suggesting their role as bio-stimulants. Finally, evidence has been obtained that these strains may also be involved in inducing drought tolerance in Arabidopsis. The use of both wild type and KO mutant strains of C. reinhardtii led to the conclusion that the biocontrol capacity, bio-stimulant and drought tolerance is due to the production of CKs. These results provide preliminary evidence that the C. reinhardtii may be a potential competitor to conventional agricultural fertilisers and products and that soon it may be used as a sustainable solution in bio-fertilisation and biocontrol