Avaliação de efeitos sinérgicos entre compostos fenólicos do Cymbopogon citratus.

Abstract

O Cymbopogon citratus é uma planta do Sudoeste asiático, existindo principalmente nas regiões tropicais e subtropicais. Esta planta é usada na medicina tradicional como infusão e decocção das folhas, para tratar várias patologias entre as quais, síndromes gripais, febre, dor e infeções microbianas. Deste modo, os compostos responsáveis pelas atividades verificadas, têm sido estudados e caracterizados, sendo que os compostos fenólicos têm sido associados a muitas das atividades atribuídas a esta planta. Os compostos fenólicos presentes no infuso evidenciaram atividades antioxidante e anti-inflamatória. Assim, com vista à seleção da melhor forma de utilização da planta (extrato, frações ou compostos fenólicos isolados) nas atividades mencionadas, torna-se necessário conhecer a contribuição de cada classe de fenóis, bem como a existência de interações sinérgicas entre estes para a atividade total do extrato. Neste sentido, o presente trabalho pretende estudar as interações sinérgicas entre as classes de fenóis presentes no infuso de Cymbopogon citratus, recorrendo a dois dos métodos mais usados (método do isobolograma e método de Chou-Talalay).Após a preparação do infuso, este foi fracionado por várias técnicas separativas, nomeadamente: cromatografia de fase reversa, cromatografia de exclusão molecular e extração em fase sólida. As frações obtidas foram monitorizadas por TLC e HPLC-PDA. Do fracionamento resultaram cinco frações: flavonóides, ácidos fenólicos, taninos de baixo peso molecular, com 1 a 4 unidades monoméricas (TI), oligómeros e polímeros de taninos (TII) e uma mistura de taninos resultante das frações TI e TII. A atividade anti-inflamatória e a citotoxicidade do extrato e das frações foram avaliadas em macrófagos estimulados pelo LPS. A amostra mais ativa foi a fração dos taninos TI com um EC50 de 43,41 ±1,074 µg/ml seguido dos flavonóides (EC50 = 64,14 ±1,072 µg/ml), extrato (EC50 = 90,56 ±1,069 µg/ml), taninos (EC50 = 166,2 ±1,268 µg/ml) sendo os ácidos fenólicos os menos ativos (EC50 = 215,1 ±1,037 µg/ml). Não foi possível determinar o EC50 dos taninos TII por terem apresentado atividade pro-inflamatória.Com base nos valores de EC50 obtidos e da proporção de cada classe de fenóis no extrato prepararam-se misturas das amostras acima mencionadas e realizaram-se ensaios com vista a verificar a existência de interações sinérgicas para a atividade anti-inflamatória e a citotoxicidade em macrófagos estimulados com LPS. As misturas testadas foram: flavonóides e ácidos fenólicos (proporção 6,5:1); flavonóides e taninos TI (proporção 1,5:1); e flavonóides e taninos (proporção 1,57:1). Os resultados experimentais permitiram concluir a existência de sinergismo em todas as misturas testadas, mas em baixas concentrações. A mistura de flavonóides e ácidos fenólicos apresentou sinergismo entre 14,42 e 57,69 µg/ml, a de flavonóides e taninos TI na concentração de 20,83 µg/ml e a de flavonóides e taninos entre 20,45 e 40,90 µg/ml. Acima destas concentrações, as misturas foram aditivas ou antagónicas. Os resultados obtidos permitem concluir que os constituintes são mais ativos em mistura do que isoladamente, tendo-se verificado sinergismos para baixas concentrações.

Cymbopogon citratus is a plant in Southwest Asia, existing mainly in tropical and subtropical regions. This plant is used in traditional medicine as infusion and decoction of the leaves, to treat several pathologies among which, flu syndromes, fever, pain and microbial infections. In this way, the compounds responsible for the verified activities have been studied and characterized, and the phenolic compounds have been associated to many of the activities attributed to this plant. The phenolic compounds present in the infusion evidenced antioxidant and anti-inflammatory activities. Thus, in order to select the best way of using the plant (extracts, fractions or isolated phenolic compounds) in the mentioned activities, it is necessary to know the contribution of each class of phenols, as well as the existence of synergistic interactions between them for the activity of the extract.In this sense, the present work intends to study the synergic interactions between the classes of phenols present in the infusion of Cymbopogon citratus, using two of the most used methods (isobologram method and Chou-Talalay method).After preparation of the infusion, it was fractionated by several separative techniques, namely reverse phase chromatography, molecular exclusion chromatography and solid phase extraction. Fractions obtained were monitored by TLC and HPLC-PDA. Fractionation resulted in five fractions: flavonoids, phenolic acids, low molecular weight tannins, with 1 to 4 monomeric units (TI), oligomers and polymers of tannins (TII) and a mixture of tannins resulting from the TI and TII fractions. The anti-inflammatory activity and the cytotoxicity of the extract and fractions were evaluated in LPS-stimulated macrophages. The most active sample was the fraction of TI tannins with an EC50 of 43.41 ± 1.074 μg/ml followed by flavonoids (EC50 = 64.14 ± 1.072 μg/ml), extract (EC50 = 90.56 ± 1.069 μg/ml ), tannins (EC50 = 166.2 ± 1.268 μg/ml) and phenolic acids were the least active (EC50 = 215.1 ± 1.037 μg/ml). It was not possible to determine the EC50 of the TII tannins because they presented pro-inflammatory activity.Based on the EC50 values obtained and the proportion of each class of phenols in the extract, mixtures of the above-mentioned samples were prepared and assays were performed to verify the existence of synergistic interactions for anti-inflammatory activity and cytotoxicity in macrophages stimulated with LPS. The mixtures tested were: flavonoids and phenolic acids (6.5:1 ratio); flavonoids and TI tannins (1.5:1 ratio); and flavonoids and tannins (1.57:1 ratio). The experimental results allowed to conclude the existence of synergism in all the mixtures tested, but in low concentrations. The blend of flavonoids and phenolic acids showed synergism between 14.42 and 57.69 μg/ml, that of flavonoids and TI tannins at a concentration of 20.83 μg/ml and that of flavonoids and tannins between 20.45 and 40.90 μg/ml. Above these concentrations, the mixtures were additive or antagonistic.The results obtained allow us to conclude that the constituents are more active in mixture than in isolation, with synergisms occurring at low concentrations.