Biological effects of new BACE1 inhibitors for Alzheimer's disease treatment

Abstract

A Doença de Alzheimer (DA) é a maior causa de demência na população idosa. Esta doença é caracterizada por uma perda progressiva de memória e funções cognitivas, que resultam da perda sináptica e neuronal. As duas maiores características histológicas da DA são as placas neuríticas extracelulares constituídas por Péptido Beta Amilóide (Aβ) e as tranças neurofibrilares formadas por tau hiperfosforilada. A formação de Aβ por proteólise da Proteína Precursora Amilóide (APP) através da via amiloidogénica é o passo crucial no desenvolvimento da DA. O processamento amiloidogénico da APP resulta de uma clivagem inicial mediada pela Enzima de Clivagem da APP no sítio β 1 (BACE1) seguida de uma clivagem mediada pela γ-secretase. Assim, a BACE1 foi identificada como um possível alvo de intervenção terapêutica na DA visto que a sua inibição irá impedir a formação de Aβ em consequência do processamento da APP. Resultados prévios revelaram que o novo inibidor da BACE1 Péptido-x (PEPx), desenvolvido pela nossa equipa no Centro de Neurociências e Biologia Celular, reduz os níveis de Aβ40, Aβ42 e de APP β Solúvel (sAPPβ), outro produto da clivagem da APP pela BACE1. De forma a compreender mais profundamente os mecanismos de captação celular do PEPx, bem como os efeitos da inibição da BACE1 em vários eventos neurológicos subjacentes à neurodegeneração na DA, investigámos a captação endocítica do composto in vitro e avaliámos in vivo num modelo animal da DA, os Murganhos Triplo Transgénicos (3xTg-DA), os efeitos de um tratamento crónico relativamente à perda sináptica, neuroinflamação e morte celular. Neste trabalho, usando a linha celular Neuro-2a (N2a) avaliámos por microscopia de fluorescência em células vivas a captação celular por via endocítica do PEPx marcado com um fluoróforo usando uma solução hipertónica de sacarose, um inibidor de amplo espectro da endocitose, e a Clorpromazina (CPZ), um inibidor farmacológico da endocitose mediada por clatrina. Por outro lado, os estudos in vivo foram realizados em murganhos 3xTg-DA tratados diariamente (injecção i.p.) com solução salina ou com PEPx durante 4 meses. Murganhos Não Transgénicos (Non Tg) da mesma idade e da mesma estirpe foram usados como controlo das vias patogénicas que os murganhos 3xTg-DA desenvolvem de forma dependente da idade. Nós observámos que, nas células N2a, o PEPx internalizado se distribuiu em estruturas citoplasmáticas de aparência vesicular. A internalização em estruturas vesiculares foi inibida na presença de uma concentração elevada de sacarose e pela CPZ, sugerindo que o PEPx é internalizado essencialmente por endocitose mediada por clatrina. In vivo, o tratamento crónico com PEPx levou ao aumento dos níveis de SYP em murganhos 3xTg-DA. Visto que a SYP não sofreu alteração em murganhos 3xTg-DA com 8.5 meses tratados com solução salina em comparação com os murganhos Non Tg, os efeitos do tratamento com PEPx sugerem um ganho sináptico. Em relação à neuroinflamação, o inibidor da BACE1 diminuiu os níveis de NLRP3 em murganhos 3xTg-DA, sugerindo uma diminuição da formação do inflamossoma. Os níveis de NLRP3 em murganhos Non Tg não foram detectáveis. Concluindo, estes resultados sugerem que a inibição do processamento da APP, para além de uma diminuição da produção de Aβ, tem um efeito benéfico em relação à perda sináptica e à neuroinflamação.

Alzheimer's Disease (AD) is the major cause of dementia in the elderly population. AD is characterised by a progressive loss of memory and cognitive functions, that arise from synaptic and neuronal loss. The two major histological hallmarks of AD are the extracellular neuritic plaques composed of Amyloid Beta Peptide (Aβ) and the intracellular neurofibrillary tangles formed by hyperphosphorylated tau. The Aβ production due to Amyloid Precursor Protein (APP) proteolysis through the amyloidogenic pathway is believed to be the crucial step in the development of AD. The amyloidogenic APP processing is carried out by sequential cleavage mediated by the β-Site APP-Cleaving Enzyme 1 (BACE1) and γ-secretase. Thus, BACE1 has been identified as a possible target for therapeutic intervention in AD since its inhibition would halt the formation of Aβ upon APP processing. The BACE1 inhibitor Peptide-x (PEPx), developed by our team at the Centre of Neuroscience and Cell Biology, has previously showed to decrease the levels of both Aβ40 and Aβ42, and also Soluble APP β (sAPPβ), another product of APP cleavage by BACE1. To more thoroughly understand the mechanisms of cellular uptake of PEPx, as well as the effects of the BACE1 inhibitor upon several neurotoxic events underlying AD neurodegeneration, we investigated in vitro the compound’s endocytic uptake, and evaluated in vivo, using the Triple-Transgenic Mouse Model of AD (3xTg-AD), the synaptic loss, neuroinflammation, and cell death, after a chronic treatment with PEPx. In this work, using the Neuro-2a (N2a) cell line we assessed by live cell fluorescence microscopy the endocytic uptake of fluorophore-labelled PEPx using a hypertonic sucrose solution, a broad-spectrum endocytosis inhibitor, and Chlorpromazine (CPZ), a pharmacological inhibitor of endocytosis mediated by clathrin. On the other hand, in vivo studies were performed on the 3xTg-AD daily treated (i.p. injection) with saline or PEPx during four months. Age-matched Non Transgenic Mice (Non Tg) with the same strain background were used as a control of pathological pathways developing in 3xTg-AD mice in an age-dependent manner. We observed that, in N2a cells, PEPx internalization gave rise to a cytoplasmic vesicular staining which was reduced in the presence of a high sucrose concentration and with the application of CPZ, thus suggesting that the main pathway of internalization of the peptide is the clathrin-mediated endocytosis. In vivo, the chronic treatment with PEPx lead to an increase in Synaptophysin (SYP) levels in 3xTg-AD mice. Since SYP was not altered in 8.5-month-old 3xTg-AD mice treated with saline regarding Non Tg mice, the effect of PEPx treatment suggests a synaptic gain. Regarding neuroinflammation, the BACE1 inhibitor decreased NOD-Like Receptor Protein 3 (NLRP3) levels in 3xTg-AD mice suggesting diminished inflammasome assembly. The NLRP3 levels in Non Tg mice were undetectable. Taking together, these results suggest that inhibition of the amyloidogenic APP processing, beyond a decrease in Aβ production, has a benefit regarding synaptic loss and neuroinflammation.