Development of a striatal lentiviral mouse model of Spinocerebellar ataxia type 2

Abstract

Spinocerebellar ataxia type 2 (SCA2) is an autosomal dominant ataxia caused by an expansion of ‘CAG’ repeats in the exon 1 of the gene ATXN2, conferring a gain of toxic function that triggers the appearance of the disease phenotype. The disease is characterized by several symptoms including progressive gait ataxia and dysarthria, slow saccadic eye movements, sleep disturbances, cognitive impairments and psychological dysfunctions such as insomnia and depression, among others. The available treatments rely on palliative care alone, which mitigate some of the major symptoms but ultimately fails to block the disease progression. This current lack of effective therapies highlight the need to create new platforms, allowing the study of the disease molecular basis and the development of new therapeutic strategies. For many years, this depended upon the analysis of postmortem tissues from deceased patients, which can provide data with great biological significance but are limited to the terminal stages of this disease. However, the identification of the causative mutation related to SCA2 and the development of state-of-the-art molecular technologies paved the way for the creation of some models in yeast, C. elegans, D. melanogaster and mice. These models have provided the researchers with greater insight into the molecular pathways of the disorder to reinforce the human patient’s data. Furthermore, a set of 4 transgenic and 1 knock-in mouse successfully recreated many of the SCA2 major symptoms, including gait ataxia, motor incoordination and neuropathological features such as ataxin-2 inclusions and cerebellar degeneration. This set of characteristics make these mice invaluable to deepen our understanding of the human disease and also reliable platforms to test for new therapeutic alternatives. Notwithstanding this, the available models have focused mainly on the cerebellar dysfunctions that characterize SCA2, while other brain regions and their contributions to the pathophysiology of this disease remain generally unexplored. Indeed, the anomalies in the cerebellum cannot explain all of the symptoms displayed by the human patients, suggesting that other brain areas might be affected as well. One of these areas is the striatum, which has been reported to display mutant ataxin-2 inclusions and neurodegeneration, that might be responsible for the cognitive impairments and the parkinsonism often observed in patients. In this work, we have used lentiviral vectors to overexpress a full-length mutated version of ataxin-2 in the striatum of C57BL/6 mice, successfully inducing a neuronal dysfunction phenotype. However, no ubiquitinated inclusions were detected nor a neuroinflammatory response was observable at 8 weeks of age. Interestingly, this time point was enough to detect a clear synaptic dysfunction in the striatum, which could be the cause for the hyperactive exploratory behavior displayed by these mice. Furthermore, the unilateral injection of ATXN2MUT in the striatum induced a mild ipsilateral turning behavior that suggests impairment in the dopaminergic transmission. In conclusion, we present an alternative modeling strategy for SCA2 that might disclose the contribution of the striatum to disease progression and study particular characteristics of this disorder that were not possible with the existing models.

A ataxia espinocerebelosa do tipo 2 (SCA2) é uma doença genética autossómica dominante que tem como causa uma expansão do trinucleótido ‘CAG’ no exão 1 do gene ATXN2. Este número anormal de repetições confere propriedades tóxicas à proteína ataxina-2, resultando em morte e disfunção neuronal e induzindo assim o desenrolar da patologia. Esta doença é caracterizada por uma série de sintomas de carácter progressivo, como por exmplo: ataxia locomotora, disartria, distúrbio dos movimentos oculares sacádicos, perturbações do sono, disfunções cognitivas e perturbações psiquiátricas como depressão, insónias, entre outros. Até à data, não existe nenhum tratamento que modifique a progressão da doença, sendo que as únicas opções terapêuticas consistem em medidas de cuidados paliativos e de melhoria da qualidade de vida. Esta situação apela à criação de novas plataformas de estudo da SCA2 que permitam estudar em maior detalhe o desenvolvimento da doença, bem como testar novas alternativas terapêuticas. Durante vários anos, estes estudos estavam limitados à análise de tecidos post-mortem de doentes, que naturalmente estavam limitados ao estádio terminal da doença. Este facto impossibilitava o estudo dos primeiros mecanismos moleculares que levam ao seu desenvolvimento. No entanto, esta situação foi revertida com a descoberta da mutação causadora de SCA2, e a consequente criação de vários modelos celulares e animais em leveduras (Saccharomyces cerevisiae), nemátodes (Caenorhabditis elegans), mosca-dafruta (Drosophila melanogaster) e ratinho (Mus musculus). Estes estudos permitiram aprofundar os mecanismos moleculares por detrás da doença e também as funções celulares da proteína ataxina-2, reforçando assim os dados provenientes de tecido humano. Por fim, o desenvolvimento de vários modelos transgénicos e de knock-in em ratinhos possibilitou recriar vários sintomas de SCA2 nos animais, incluindo descoordenação motora, degenerescência do cerebelo e a formação de agregados de ataxina-2. Estes animais constituem assim um recurso valioso para aprofundar o nosso conhecimento desta patologia bem como para testar o efeito de novos fármacos e estratégias terapêuticas. No entanto, os modelos descritos até ao momento focam-se quase exclusivamente numa única zona do cérebro – o cerebelo – relegando para segundo plano outras regiões que também estão envolvidas em SCA2. Uma destas zonas é o estriado, no qual já foi descrito em doentes a presença de inclusões ubiquitinadas bem como neurodegenerescência. O facto de muitos doentes sofrerem de Parkinsonismo, chegando até a responder positivamente ao tratamento com Levodopa, parece reforçar a tese de que o estriado contribui para o desenvolvimento da patologia, apesar deste tópico não estar de todo esclarecido. No decorrer deste projeto, usámos lentivirus recombinantes para induzir a expressão de ataxina-2 mutante no estriado de ratinhos WT, e gerámos com sucesso um fenótipo de disfunção neuronal nesta região cerebral. Apesar de não termos observado a presença de inclusões ubiquitinadas nem de uma resposta neuroinflamatória clara, descrevemos uma série de alterações nos níveis de proteína e RNA de vários constituintes sináticos, bem como alterações comportamentais exibidas por estes animais. Por fim, também observámos que os animais injetados unilateralmente com ataxina-2 mutante possuem um comportamento rotativo tendencioso, indicando uma possível disfunção na transmissão dopaminérgica do estriado. Em resumo, nesta dissertação apresentamos uma estratégia alternativa para modelar a ataxia espinocerebelosa do tipo 2 em ratinho, que contribuiu para aprofundar o papel do estriado no desenvolvimento da patologia. Também acreditamos que no futuro será um modelo valioso para estudar determinadas características desta doença que não seriam possíveis com outros modelos existentes