Functional Investigation of OXPHOS assembly factors in Leber’s Hereditary Optic Neuropathy

Abstract

Mitochondrial cytopathies comprise a heterogeneous group of multisystem disorders related to mitochondrial dysfunction and deficiency in ATP production. The tissues more susceptible to this impairment are those that require more energy for their maintenance and function, such as the nervous system having a higher number of mitochondria per cell. The energy dysfunction may occur in one or more complexes of the mitochondrial respiratory chain (MRC). Since MRC subunits are encoded by both nuclear genome (nDNA) and mitochondrial DNA (mtDNA), the pathology may be caused by diverse types of mutations in one or both genomes. Accordingly, mutations in mtDNA, although responsible for a significant number of pathologies, may exhibit incomplete "penetrance", suggesting the involvement of other factors such as mtDNA haplogroups, nDNA single nucleotide polymorphisms (SNPs), or alcohol, tobacco and other environmental factors. Leber’s hereditary optic neuropathy (LHON) is one of the most common mitochondrial cytopathies. It is mainly characterized by degeneration of retinal ganglion cells, causing blindness in young males. It is estimated that ~70% of LHON cases are due to the point mutation m.11778G>A that is responsible for encoding the ND4 Complex I (CI) subunit. However, mtDNA mutations do not always explain the incomplete “penetrance” verified. Accordingly, it may be predicted that mutations in nDNA may play a synergistic role with mtDNA alterations for causing a severe biochemical defect. Moreover, modifications in nDNA coding for mitochondrial factors of major importance to the assembly, stability and maintenance of the MRC, may lead to an imbalance in oxidative phosphorylation (OXPHOS)-dependent energy production, compromising mitochondrial function. The assembly factors, despite not being part of MRC structure, play a crucial role in the correct complexes assembly for an adequate energy production. Therefore, the present study aims to clarify the role of MRC assembly in LHON, pathology, related to the presence and absence of the m.11778G>A mutation. A genetic, structural, and functional set of analyses were performed. The results show that, in patients harbouring the referred primary LHON mutation, the CI activity is highly reduced. The analysis of the MRC complexes’ assembly status allowed to observe that patients 1 and 4 present impaired assembly of CI, and patient 4 also shows decreased assembled CV. The genetic analysis of the assembly factors revealed a promising sequence variation only in patient 1, under characterization.In conclusion, the present results are a promising and the impairment of the MRC assembly may be an important issue to consider in LHON, although there are other factors to be taken into account in the pathological mechanism underlying the disease.

As citopatias mitocondriais incluem um grupo heterogéneo de doenças multissistémicas associadas à disfunção mitocondrial, o que leva a uma insuficiência na produção de ATP. Os tecidos que requerem maiores níveis de energia para a sua manutenção e funcionamento, como o sistema nervoso, apresentam um maior número de mitocôndrias por célula, sendo os mais afetados. Os défices energéticos podem afetar um ou mais complexos da cadeira respiratória mitocondrial (MRC). Dado que as subunidades dos complexos da MRC são codificadas, tanto por DNA nuclear (nDNA), como por DNA mitocondrial (mtDNA), estas doenças podem ter origem em mutações localizadas em um ou nos dois genomas. Consequentemente, mutações no mtDNA embora responsáveis por um número significativo de patologias, podem exibir “penetrância incompleta”, sugerindo que existem outros fatores envolvidos, tais como haplogrupos mitocondriais, polimorfismos (SNPs), consumo de álcool, tabaco e fatores ambientais. A neuropatia ótica hereditária de Leber (LHON) é uma das citopatias mitocondriais mais frequentes. É caraterizada principalmente pela degenerescência das células ganglionares da retina (RGC), causando cegueira, principalmente em adultos jovens do sexo masculino. Estima-se que cerca de 70% dos casos de LHON sejam devidos à mutação m.11778G>A, que codifica a subunidade ND4 do complexo I (CI). Contudo, as mutações no mtDNA não explicam sempre a existência de “penetrância incompleta”. Assim, prevê-se que alterações no nDNA, em sinergia com mutações no mtDNA possam gerar um fenótipo bioquímico grave. Para além disso, modificações no nDNA, em fatores mitocondriais, podem levar à função alterada de proteínas importantes para a montagem, estabilidade e manutenção da MRC, comprometendo a função mitocondrial normal e a produção de energia na fosforilação oxidativa (OXPHOS). Os fatores de assembly, embora não façam parte da estrutura final da MRC, fazem parte do grupo de fatores codificados pelo nDNA e têm um papel fundamental para que a montagem dos complexos seja eficaz, de modo a assegurar uma produção de energia adequada. Assim, o presente estudo tem como objetivo clarificar o papel do assembly da MRC na patologia da LHON relacionada com a presença ou ausência da mutação m.11778G>A. Foi realizado um estudo genético, estrutural e funcional. Os resultados mostram que, em doentes com a mutação primária, a atividade do CI é mais baixa. A análise do estado de assembly dos complexos da MRC permitiuobservar que os doentes 1 e 4 têm alteração do assembly do CI, e que o doente 4 apresenta também decréscimo no assembly do CV. A análise genética do doente 1 revelou uma alteração muito promissora num dos fatores de assembly, que se encontra em caraterização. Em conclusão, os resultados do presente trabalho são promissores e a falha no assembly da MRC parece ser um importante parâmetro a considerar na LHON, embora haja outros fatores a ter em conta nos mecanismos patogénicos subjacentes à manifestação da doença.