Regulation of ECM mimetics during oligodedrocytes differentiation in vitro

Abstract

Oligodendrocytes (OLs) are the myelin-producing cells of the central nervous system (CNS). Their differentiation undergoes different maturation stages: neural progenitors, oligodendrocyte precursor cells (OPCs), pre-OLs, immature OLs, nonmyelinating mature OLs and myelinating mature OLs. The latter provide the insulation of axons and facilitate the conduction of action potentials. Loss of the myelin sheath occurring in demyelinating diseases leads to anomalous nerve transmission and neuronal cell death, as in multiple sclerosis (MS). The failure in remyelination and inhibition of de novo oligodendrocytes differentiation observed in neurodegenerative diseases may be partially caused by modifications in the extracellular matrix (ECM) composition and rigidity due to scar tissue formation following lesion of the affected areas. This may result in imbalance of the normal physiological ECM-induced signal transduction into cells present in those areas. Extracellular matrix composition and its mechanical properties play a key role in cellular differentiation. OLs differentiation is modulated by ECM proteins like laminin, vitronectin and fibronectin. These ECM components bind to and activate integrins, triggering multiple intracellular signalling events, in which the actin cytoskeleton and myosin motor proteins seem to play a key role. For example, laminin-2 (merosin) is known to bind α6β1-integrins and promote OLs differentiation and myelination. Additionally, this differentiation process seems to be directly affected by the substrate elasticity, as showed recently. Mammalian tissues present different rigidities, ranging from 0.1 to 30,000,000 kPa. Cells also sense the rigidity of their environment when cultured in vitro and seem to respond better when on substrates that mimic the stiffness of their native microenvironment. Depending on the substrate elasticity, neural stem cells either become neuronal when cultured on soft substrates (0.01 to 0.5 KPa); or glial, when cultured on slightly stiffer ones (1 to 10 KPa). This effect has been suggested to recapitulate the development of the CNS, since neurons develop first (on a softer environment) and glial cells later (stiffer environment), hence each cell type is originated in vitro in response to its respective compliant substrate. We have created a setup based on functionalised polyacrylamide hydrogels with different degrees of stiffness, that was used for cell culture. We obtained hydrogels with a range of stiffness between 0.1KPa and 6.5KPa (stiffness of brain ranges from 0.1KPa to 10KPa). Hydrogels were functionalised with poly-D-lysine (PDL), fibronectin (FN), PDL/FN or PDL/merosin, and CG-4 cells [oligodendrocyte-type 2-astrocyte (O-2A) cell line] were successfully seeded on these hydrogels. CG-4 cells cultured on the stiffest hydrogel (about 6.5KPa) in proliferation medium seemed to respond to the substrate stiffness and the ECM proteins tested, displaying a more progenitor-like bipolar morphology or a more branched and differentiated-like morphology more effectively when in presence of fibronectin or merosin, respectively. Additionally, CG-4 cells seemed to differentiate faster on functionalised hydrogels than on coated coverslips when in presence of differentiation medium.

No sistema nervoso central os oligodendrócitos são as células responsáveis pela produção da bainha de mielina. Durante o processo de diferenciação estes passam por diferentes fases de maturação: progenitores neurais, células progenitoras de oligodendrócitos, pré-oligodendrócitos, oligodendrócitos imaturos, oligodendrócitos maduros não mielinizantes e oligodendrócitos maduros mielinizantes. A mielinização é um processo que promove o isolamento de axónios, facilitando a condução de potenciais de ação. A perda da bainha de mielina – desmielinização - leva a uma condução anómala da transmissão nervosa e à morte neuronal. A falha na remielinização e a inibição da diferenciação de oligodendrócitos de novo observada nas doenças neurodegenerativas, como por exemplo, na esclerose múltipla pode ser causada em parte por alterações na composição e rigidez da matriz extracelular, devido às lesões do tecido nas zonas afetadas. O que pode conduzir a um desequilíbrio da transdução de sinais entre a matriz extracelular e as células nas zonas afetadas. A composição e as propriedades mecânicas da matiz extracelular são cruciais para a diferenciação celular. A diferenciação de oligodendrócitos é modulada por proteínas da matriz extracelular, como por exemplo: laminina, vitronectina e fibronectina. Estes componentes ligam e ativam integrinas que por sua vez ativam múltiplas vias de sinalização, nos quais o citoesqueleto de actina e as proteínas motoras, como a miosina, parecem ter um papel importante. Por exemplo, é sabido que a ligação da laminina-2 (merosina) a integrinas α6β1 promove a diferenciação de oligodendrócitos e mielinização. Foi demonstrado recentemente que este processo parece ser afetado pela rigidez do substrato. Os tecidos dos mamíferos apresentam uma gama de rigidez entre 0,1 e 30.000.000kPa. As células têm mecanismos que as tornam capazes de ‘sentir’ a rigidez do substrato quando cultivadas in vitro e parecem responder melhor em substratos que mimetizem a rigidez do seu microambiente nativo. Em resposta à alteração da rigidez do substrato as células estaminais neurais podem-se diferenciar em linhagens neuronais em substratos mais moles (0,01 a 0,5 KPa); ou em linhagens de glia quando cultivadas em substratos mais duros (entre 1 e 10 KPa). Este processo tem sido sugerido como uma recapitulação do desenvolvimento do sistema nervoso central, uma vez que os neurónios se desenvolvem primeiro num microambiente mais mole e, seguidamente, ocorre o desenvolvimento das células da glia num ambiente mais rígido. Assim, cada tipo celular pode ser originado in vitro em resposta à rigidez do substrato. Foram criados hidrogéis de poliacrilamida com diferentes níveis de rigidez, os quais foram funcionalizados com diferentes proteínas e, posteriormente, utilizados em cultura de células. Os hidrogéis obtidos apresentam uma gama de rigidez entre 0,1KPa e 6,5KPa (a gama de rigidez do cérebro varia entre 0,1 e 10 KPa). Os géis foram funcionalizados com poli-D-lisina (PDL), fibronectina (FN), PDL/FN ou PDL/merosina e, seguidamente foram cultiva células CG- 4 (linha celular de oligodendrócito-tipo 2-astrócito) nos diferentes géis com sucesso. As células CG-4 cultivadas no gel mais rígido (cerca de 6,5KPa) em meio de proliferação aparentaram responder à rigidez do substrato e às proteínas da matriz extracelular testadas, apresentado uma morfologia mais bipolar, assemelhando-se a células progenitoras de oligodendrócitos ou uma morfologia mais ramificada, assemelhando-se a células diferenciadas, quando cultivadas na presença de fibronectina ou merosina, respetivamente. Além disso, na presença de meio de diferenciação a diferenciação das células CG-4 pareceu ser mais rápida nos hidrogéis funcionalizados do que nas lamelas com ‘coating’.