Análise funcional de maltocinases e trealose sintases/maltocinases bifuncionais

Abstract

Foi recentemente descoberta em Mycobacterium tuberculosis uma nova via para a síntese de α-glucanos a partir de trealose, que foi validada a nível genético como um novo alvo promissor para o desenvolvimento de novos fármacos contra a tuberculose. Nesta via intervêm várias enzimas, nomeadamente a trealose sintase (TreS) e a maltocinase (Mak). A unidade transcripcional treS/mak está presente numa grande variedade de procariotas, incluindo apenas um arqueão. Em alguns microrganismos estes genes encontram-se fundidos num só, codificando uma enzima bifuncional, a trealose sintase/maltocinase (TreS/Mak). Foram construídas árvores filogenéticas com sequências de Maks, TreSs e TreS/Maks de diferentes microrganismos de modo a constatarmos a distribuição destas enzimas nos diferentes grupos filogenéticos. A partir de uma destas árvores, foram seleccionadas algumas enzimas Mak e TreS/Mak de microrganismos dos diferentes grupos formados para confirmação da sua função biológica. Efectuou-se seguidamente um estudo funcional das enzimas Mak e TreS/Mak seleccionadas. As sequências de algumas Maks apresentam valores de homologia moderados entre os diferentes organismos e, até à data, nenhuma fusão TreS/Mak foi caracterizada. Os genes mak e treS/mak selecionados foram amplificados, clonados e expressos em E. coli, que não possui actividade de Mak, tendo sido produzidas recombinantemente com sucesso quatro enzimas Mak e uma enzima TreS/Mak bifuncional. Seguidamente, foram realizados ensaios para testar a actividade destas enzimas em extracto, designadamente a sua especificidade para cada um dos substratos potenciais e a possível actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase observada em algumas enzimas com sequências com homologia relevante com Maks e responsáveis pela inactivação de alguns antibióticos desta classe. As enzimas Mak expressas com sucesso apresentaram a actividade esperada em extracto e, dos diferentes aceitadores de grupos fosfato testados, apenas a maltose foi utilizada com eficiência na síntese de maltose-1-fosfato, enquanto que ATP, GTP e UTP foram dadores de fosfato eficientes na síntese daquele metabolito. Nos ensaios efectuados com antibióticos aminoglicosídeos não detectámos actividade, o que indica que as enzimas estudadas não apresentam actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase nas condições testadas. A enzima recombinante TreS/Mak de Pseudomonas fluorescens não apresentou a actividade esperada, isto é, a conversão directa de trealose em maltose-1-fosfato, tendo sido obtido um composto desconhecido como produto. Foram obtidos espectros de ressonância magnética nuclear (RMN) com vista à identificação do composto, tratandose aparentemente de uma hexose bifosforilada. Esta enzima bifuncional utilizou maltose, trealose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose e maltoheptaose na síntese deste composto e apenas ATP foi utilizado como dador de grupos fosfato. Nos ensaios efectuados com antibióticos aminoglicosídeos, também não detectámos actividade, o que sugere que a TreS/Mak de Pseudomonas fluorescens não apresenta actividade de aminoglicosídeo fosfotransferase. Os resultados obtidos com este trabalho fornecem provas concretas sobre a identidade de maltocinases hipotéticas de vários grupos taxonómicos e servirá como base para trabalhos futuros que visem explorar a evolução não só destas enzimas, como também da via metabólica que canaliza trealose para a síntese de importantes polissacáridos de reserva como o glicogénio, ou com função mais específica, como por exemplo os α-glucanos da cápsula ou os polissacáridos de metilglucose de micobactérias, através de maltose-1-fosfato sintetizada por maltocinases.

A new pathway for the synthesis of α-glucans from trehalose has been recently discovered in Mycobacterium tuberculosis, and it has been genetically validated as a new promising target for the development of new drugs against tuberculosis. Diverse enzymes are involved in this pathway, namely trehalose synthase (TreS) and maltokinase (Mak). The transcriptional unit treS/mak is present in a range of prokaryotes including only one archeal species. The treS and mak genes are fused in some microorganisms, encoding a bifunctional enzyme, trehalose synthase/maltokinase (TreS/Mak). We built phylogenetic trees with Mak, TreS and TreS/Mak sequences from different microorganisms to examine the enzyme distribution in the different phylogenetic groups. Mak and TreS/Mak enzymes from microorganisms of the different groups were selected from one of these trees to confirm their biological function. Subsequently, a functional study of the selected Mak and TreS/Mak enzymes was carried out. The Mak sequences have moderate homology values between the different organisms and, until now, no TreS/Mak fusion was characterized. The selected mak and treS/mak genes were amplified, cloned and expressed in E. coli, which lacks Mak activity, and four recombinant Maks and one recombinant TreS/Mak were successfully produced. Afterward, assays to test the activity of these enzymes in cell extracts were performed, namely their specificity to each of the potential substrates and the possible activity of aminoglycoside phosphotransferase, which was observed in a few enzymes with relevant homology with Maks and responsible for the inactivation of some aminoglycoside antibiotics. The successfully expressed Mak enzymes exhibited the expected activity and, among the different acceptors tested only maltose was efficiently used in the production of maltose-1-phosphate while ATP, GTP and UTP were efficient phosphate donors to the synthesis of the phosphorylated metabolite. Activity was not detected in the assays performed with aminoglycoside antibiotics, which indicates that these enzymes lack aminoglycoside phosphotransferase activity, at least in the conditions tested. The activity of the recombinant TreS/Mak from Pseudomonas fluorescens was unexpected, since this enzyme produced an unknown compound instead of maltose-1- phosphate. Nuclear magnetic resonance spectra were obtained to identify the compound, which seems to be a biphosphorylated hexose. This TreS/Mak enzyme used maltose, trehalose, maltotriose, maltotetraose, maltopentaose and maltoheptaose to produce this compound and only ATP was used as a phosphate donor. Activity was also not detected in the assays performed with aminoglycoside antibiotics, which suggests that this enzyme lacks aminoglycoside phosphotransferase activity. The results obtained with this work provide concrete evidence about the identity of hypothetical maltokinases from several taxonomic groups and will serve as a base for future work aiming to explore the evolution of these enzymes and of the pathway that channels trehalose for the synthesis of important storage polysaccharides, such as glycogen or polysaccharides with a more specific metabolic function, such as capsular α-glucans or the methylglucose polysaccharides from mycobacteria, through the maltose-1-phosphate produced by maltokinases.