Drug Resistance and Cancer Stem Cells

Abstract

O cancro do pulmão é a principal causa de morte por cancro a nível mundial. Apesar do crescente conhecimento sobre os mecanismos subjacentes ao processo tumorigénico não se tem observado alteração significativa na sobrevivência dos pacientes. É, por isso, urgente encontrar novas estratégias terapêuticas que visem superar a resistência, tanto intrínseca como extrínseca, observada com a quimioterapia corrente. Os tumores são caracterizados pela sua heterogeneidade celular, devido à coexistência de diferentes subpopulações celulares, cuja organização hierárquica em certos tipos de cancro, levou à hipótese de que as células afetadas por mutações possam ser células estaminais e estar na origem do processo tumoral. No entanto, em outros tumores, células totalmente diferenciadas portadoras de mutações têm sido referenciadas como as células de origem. As células estaminais cancerígenas, são células com capacidade de autorrenovação, e diferenciação multipotente, que podem originar os diferentes tipos de células presentes no tumor. Recentemente, a fim de estudar os mecanismos envolvidos na carcinogénese pulmonar por exposição ao crómio hexavalente [Cr(VI)] foi implementado, no nosso laboratório, o primeiro sistema in vitro de transformação maligna de uma linha do epitélio bronquial humano, BEAS-2B, induzida por Cr(VI). Subsequentemente, o potencial maligno da linha celular obtida (RenG2) foi aumentado por injecções sucessivas das células em ratinhos imunocomprometidos, estabelecendo duas novas linhas celulares malignas, derivadas da inicial (DRenG2 e DDRenG2). Inesperadamente, demonstrou-se que as células estaminais cancerígenas, podem ser obtidas por desdiferenciação de células malignas do epitélio bronquial, e/ou da percursora menos maligna RenG2. Tendo em vista a caracterização biológica das linhas celulares: Cont-1, RenG2, DRenG2, DDRenG2 e BEAS-2B procedeu-se, ao estudo dos seus tempos de duplicação, pelo método de azul tripano, e da evolução citogenética desde as BEAS-2B até às DDRenG2. Após a caracterização citogenética das linhas celulares o fenótipo epitelial, mesenquimal das referidas linhas foi avaliado por imunocitoquímica (MNF116, Vimentina e Oct-4). Por fim, a resistência aos agentes quimioterapeuticos convencionalmente usados no cancro do pulmão, gemcitabina (2’2’ diflouro deoxicitidina) e da cisplatina [cis-Pt(NH3)2Cl2], foi avaliada e correlacionada com a expressão da proteína de efluxo P-Glycoproteína. O método do MTT (brometo de 3- [4,5-dimetiltialzol-2-il] -2,5-difeniltetrazólio) foi utilizado para avaliar a resistência aos referidos fármacos. A análise citogenética das linhas celulares mais malignas e proliferativas DRenG2 e DDRenG2 demonstrou que estas eram portadoras de uma alteração estrutural comum relativamente à progenitora não maligna BEAS-2B, denominada 7p-. As principais características citogenéticas da linha DRenG2 eram as alterações estruturais 7q- e da iso9q+, enquanto as da linha celular DDRenG2 eram as alterações t(7;14) e 17q+. As linhas celulares malignas RenG2, DRenG2 e DDRenG2 apresentaram uma ploidia de 75/76 cromossomas em oposição às linhas não malignas BEAS-2B e Cont-1. A análise imunocitoquímica revelou que todas as linhas celulares eram MNF116- e Vimentina-positivas mas, Otc3/4- e P-Glycoprotein-negativas. Como esperado, as linhas mais malignas, apresentaram uma maior resistência à gemcitabina e cisplatina.

Lung cancer is the most common cause of cancer death worldwide. Despite the increasing knowledge on the mechanisms underlying the tumorigenic process, there isn’t a significant increase on lung cancer patients’ survival. Due to this, it is urgent to develop new approaches that surpass the chemotherapeutic resistance, both intrinsic as acquired, observed with the current available therapeutic options. Tumours are characterized by their cellular heterogeneity due to the co-existence of different cellular sub-populations, whose hierarchic organization in certain cancers lead to the hypothesis that the target cells of transforming mutations are stem-like cells. However, in other tumours, restricted progenitors or even differentiated cells may be the cell of origin. Cancer stem cells (CSCs) are consequently, stem-like cells with self-renewal and multipotent differentiation characteristics which can originate all cell types found in a tumour. Recently, following prolonged treatment of differentiated non-tumorigenic bronchial epithelial cells (BEAS-2B) with hexavalent chormium, a known lung carcinogenic agent, a malignant cell line RenG2 was established and, subsequently, two more malignant cell lines, DRenG2 and DDRenG2, were implemented out of tumors induced in nude mice. Unexpectedly, we demonstrated that CSCs could be obtained by dedifferentiation of the malignant bronchial epithelial cells DRenG2, DDRenG2 and/or their precursor RenG2. In the present work the proliferation rate of Cont-1, RenG2, DRenG2 and DDRenG2 cell lines, and their non-malignant precursor BEAS-2B was assessed by the trypan blue method. The cytogenetic evolution from BEAS-2B to DDRenG2 was evaluated, and the epithelial/mesenchymal phenotype of the cell lines was assessed by immunocytochemistry (MNF116, Vimentin and Oct3/4). Finally, the chemoresistance of the cells lines to gemcitabine (2’2’-diflourodeoxycytidine) and cisplatin [cis-Pt(NH3)2Cl2], the most common drugs used to treat lung cancer, was evaluated and correlated to the presence of the efflux pump P- Glycoprotein. The MTT (3-[4, 5-dimethylthiazol-2-yl]-2, 5-diphenyltetrazolium bromide) assay was used to assess the ability of gemcitabine and cisplatin to reduce cells’ viability. The cytogenetic analysis of the more malignant and more proliferative DRenG2 and DDRenG2 cell lines revealed a common structural difference relative to progenitor BEAS-2B cells in chromosome 7 (7p-). However, while the predominant structural alterations in DRenG2 were the 7q- and iso9q+, DDRenG2 revealed the predominance of t(7:14) and 17q+. All the malignant cell lines, RenG2, DRenG2 and DDRenG2, predominant ploidy was 75/76 chromosomes in contrast, to their non-malignant progenitor BEAS-2B and non-malignant control Cont-1. Immunocytochemistry analysis revealed that all cell lines were MNF116- and Vimentin-positive but, Otc3/4- and P-Glycoprotein-negative. The MNF116- and Vimentin staining levels distribution revealed that all the cell lines were composed of different cellular sub- populations that account for their transition phenotypes, with BEAS-2B more epithelial while the more malignant were more mesenchymal. As expected, the more malignant cell lines were significantly more resistant to gemcitabine and cisplatin. Although, quite often multidrug resistance is associated to the overexpression of the membrane efflux pump P-Glycoprotein, other mechanism(s) may account for the observed resistance of DRenG2 and DDRenG2 cells.