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Title: A two-sided tale : the influence of environmental endocrine disruptors and sperm chromatin status on male fertility
Authors: Santos Tavares, Renata 
Orientador: Ramalho de Sousa Santos, João
Keywords: Os disruptores endocrinos ambientais afectam a função espermática humana; Exposição ambiental; Disruptores endócrinos; Disfunção reprodutora masculina; Infertilidade masculina
Issue Date: 15-Jul-2014
Citation: TAVARES, Renata Santos - A two-sided tale : the influence of environmental endocrine disruptors and sperm chromatin status on male fertility. Coimbra : [s.n.], 2014. Tese de doutoramento. Disponível na WWW: http://hdl.handle.net/10316/24996
Abstract: A exposição a contaminantes ambientais, em particular a disruptores endócrinos, tem sido associada a uma diminuição da qualidade espermática e a uma tendência acrescida de cancro testicular e anomalias nos órgãos reprodutores masculinos, dados que sugerem estes compostos como potenciais causadores de disfunção reprodutora masculina e infertilidade. De entre os mais conhecidos contaminantes com este tipo de propriedades incluem-se substâncias organocloradas como a clássica dioxina TCDD, os PCBs e o p,p’-DDE (principal metabolito do pesticida DDT), as quais representam sérios riscos para a população humana, dada a ampla disseminação e persistência das mesmas. Muito embora estas substâncias acumulem tendencialmente no tecido adiposo, têm também sido encontradas no tracto reprodutor feminino, estando assim em contacto directo com os espermatozóides. No entanto, a análise apenas de parâmetros seminais clássicos para avaliar os potenciais efeitos nefastos destes compostos na fertilidade masculina pode subestimar a sua toxicidade, sobretudo a baixas concentrações. Torna-se assim imperativa a avaliação de parâmetros funcionais mais precisos. Um destes parâmetros é a integridade da cromatina/ADN, crucial para uma correcta transmissão da informação genética paterna ao embrião. Apesar do vasto número de técnicas disponíveis para a sua análise, a ausência de valores-limite e a utilização de protocolos extensos e/ou de reagentes e equipamento dispendiosos têm dificultado a introdução da integridade da cromatina/ADN como parâmetro adicional aquando da realização de um espermograma, bem como limitado a sua avaliação em estudos de larga escala. Na primeira parte do trabalho uma abordagem in vitro permitiu mimetizar a exposição contínua aos compostos TCDD, PCB 77 e p,p’-DDE a que os espermatozóides estão sujeitos in vivo durante vários dias no tracto reprodutor feminino. Embora a exposição a TCDD não tenha comprometido os parâmetros funcionais estudados, tanto o PCB 77 como o p,p’-DDE afectaram directamente a função espermática, culminando em morte celular. A exposição a p,p’-DDE levou a uma diminuição da função mitocondrial que, em simultâneo com o decréscimo dos níveis de ATP celular, resultou numa acentuada redução da mobilidade espermática. A exposição a PCB 77 afectou igualmente a mitocôndria e a mobilidade espermática, no entanto o declínio na mobilidade precedeu a disfunção mitocondrial, sugerindo distintos mecanismos de acção para os diferentes compostos. Reforçando esta ideia, uma inibição da capacitação foi observada apenas durante a exposição a p,p’-DDE. Além disso, a homeostase do Ca2+ não foi significativamente afectada pelo PCB 77 mas foi, pelo contrário, substancialmente alterada durante a exposição a p,p’-DDE, inclusive a concentrações tão diminutas e fisiologicamente relevantes como 1 pM e 1 nM. De facto, o notável e persistente aumento dos níveis de Ca2+ intracelular proveniente do meio externo foi despoletado pela activação do canal de Ca2+ Catsper localizado na membrana plasmática. Por seu lado, a reacção acrossómica, evento fortemente dependente de Ca2+, foi também prematuramente induzida pela exposição a p,p’-DDE. Na última parte do trabalho determinámos o valor do método de coloração Diff-Quik na avaliação do estado da cromatina espermática após selecção dos espermatozóides para utilização nas técnicas de Reprodução Assistida, e a sua relação com os resultados de fertilidade obtidos. Recentemente desenvolvido pelo nosso grupo de trabalho, este método simples e barato detectou um aumento da percentagem de espermatozóides com cromatina íntegra após o processo de selecção. Adicionalmente, amostras com baixas percentagens de espermatozóides com danos na cromatina foram associados a uma melhor qualidade embrionária após ICSI e FIV e à obtenção de uma gravidez clínica após FIV, onde, apesar de toda a manipulação inerente ao procedimento, é possível ocorrer uma certa selecção “natural”. Neste último caso, 34,25% de espermatozóides com danos na cromatina foi estabelecido como valor de referência acima do qual a obtenção de uma gravidez poderá estar comprometida. Em conclusão, os compostos organoclorados p,p’-DDE e PCB 77 afectam directamente a função espermática humana via diferentes mecanismos de acção, comprometendo, em última análise, a fertilidade masculina. Tendo em conta o envolvimento do Ca2+ em diversas vias de sinalização, o seu influxo não regulado e excessivo via Catsper poderá ser responsável, pelo menos em parte, pelo declínio da função espermática observada durante a exposição ao p,p’-DDE. Pelo contrário, a exposição ao composto TCDD mostrou-se ineficaz sugerindo que os efeitos previamente descritos em espermatozóides humanos resultam de um outro mecanismo, possivelmente indirecto. Este é o primeiro estudo que descreve o envolvimento do canal de Ca2+ Catsper na acção de disruptores endócrinos. Ademais, o método de coloração Diff-Quik revelou-se uma importante ferramenta clínica com capacidade de predizer o sucesso das técnicas de Reprodução Assistida, em particular após FIV, sendo portanto sugerido como método alternativo para detecção do estado da cromatina em espermatozóides humanos em qualquer laboratório de Andrologia, quando não estejam disponíveis técnicas mais elaboradas.
Exposure to environmental toxicants, mainly endocrine disruptors, has been associated with a decline in sperm quality paralleled by a trend for increased testicular cancer and anomalies in male reproductive organs, suggesting that these substances play a role in male reproductive dysfunction and infertility. Of the more prevalent pollutants, organochlorine compounds such as the classical dioxin TCDD, PCBs and the major DDT metabolite, p,p’-DDE, are potentially serious hazards to the general human population. Although these substances preferentially accumulate in body fat, important amounts are present at the site of fertilization in vivo, representing an important direct route of exposure for spermatozoa that should not be neglected. Moreover, while often relying on the evaluation of standard semen parameters to infer about the potential damaging effects of such compounds in human male fertility, studies may have underestimate their true toxicity, mainly at low physiological concentrations. Thus, the evaluation of more precise sperm functional parameters is mandatory. One of these parameters is sperm chromatin/DNA integrity, crucial for a correct delivery of the paternal genome to the embryo. Despite the multitude of tests available, the lack of valid cut-offs and the involvement of extensive protocols and/or expensive reagents and equipment have hampered the introduction of sperm DNA damage as an additional parameter in routine semen analysis and limited its evaluation in large-scale studies. In the first part of our work an in vitro approach allowed to mimic the putative in vivo continuous exposure of human sperm to TCDD, PCB 77 and p,p’-DDE in the female reproductive tract, for several days. Although exposure to TCDD did not affect sperm function, both the dioxin-like PCB 77 and p.p’-DDE were able to directly target human sperm, promoting several alterations that culminated in cell death. p,p’-DDE exposure was found to decrease both mitochondrial function and cellular ATP levels which, collectively, resulted in a notable reduction of sperm motility. Similarly, PCB 77 affected both mitochondria and motility, but by firstly causing a decline in sperm motility followed by mitochondrial dysfunction, a different mechanism of action was suggested when compared to p,p’-DDE. Consistent with this idea, sperm capacitation was inhibited only by p,p’-DDE treatment. Furthermore, Ca2+ homeostasis, which is vital for proper sperm function, was not significantly affected by PCB 77, but was strikingly altered upon p,p’-DDE exposure, even at doses as low as 1 pM and 1 nM. The remarkable increase and sustained elevation of intracellular Ca2+ levels promoted by p,p’-DDE exposure resulted from an influx from the external environment triggered by the activation of the Ca2+-permeable cation channel Catsper localized at the plasma membrane. The acrosome reaction, which is strongly Ca2+-dependent, was prematurely triggered by p,p’-DDE. In the second part of our work we sought to determine the value of our simple, fast and inexpensive Diff-Quik staining assay in evaluating sperm chromatin status and predicting ART fertility outcomes in post-prepared samples. Similarly to what was reported using other tests, this recently described assay was able to detect an improvement of sperm chromatin integrity after sperm selection. Moreover, lower percentages of chromatin damage were associated with better quality embryos in both IVF and ICSI cycles and with clinical pregnancy success, but only in IVF treatments, where some degree of “natural” sperm selection may occur. In this case, a threshold value beyond which clinical pregnancy was significantly compromised was established at 34.25% of damaged sperm monitored by the Diff-Quik staining assay. Overall, we provide evidence that p,p’-DDE and PCB 77 promote direct (non-genomic) effects in human sperm function via different mechanisms of action, ultimately compromising male fertility. Given the involvement of Ca2+ in many vital processes relevant for sperm function, p,p’-DDE-induced non-regulated Ca2+ entry via Catsper and overload may be, at least in part, accountable for the general sperm dysfunction observed. In contrast, TCDD was ineffective in vitro suggesting that its effects on human sperm parameters may be indirect, i.e. rather resulting from alterations at other levels. To our knowledge this is the first time that Catsper has been associated with the action of endocrine disruptors. Furthermore, the Diff-Quik staining assay was confirmed to be a clinically valuable tool that provides useful information concerning the success ART, particularly in IVF cycles, and is thus suggested as an alternative method to detect sperm chromatin status in minimal clinical settings, when no other well-established assays are available.
Description: Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra
URI: https://hdl.handle.net/10316/24996
Rights: openAccess
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