Evolving the Thermostability of PpAzoR, an Azoreductase from Pseudomonas putida MET94, by Directed Evolution

Abstract

Os corantes azo são o maior grupo de corantes sintéticos utilizados na indústria, e a sua libertação no ambiente representa uma das maiores fontes de poluição a nível mundial. A PpAzoR é uma azoreductase NADPH-dependente de FMN da Pseudomonas putida MET94, capaz de reduzir vários corantes azo, em anaerobiose, às suas respetivas aminas aromáticas. Esta propriedade faz com que esta enzima seja um excelente candidato para o aplicações biotecnológicas, mas o facto de possuir uma estabilidade térmica muita baixa (tempo de meia vida a 40°C de 30 min) diminui claramente o seu potencial de utilização. Neste estudo é descrito o melhoramento da estabilidade térmica da PpAzoR por técnicas de evolução dirigida. A evolução dirigida tem mostrado ser uma ferramenta importante na otimização de algumas propriedades enzimáticas. Com base na introdução de mutações aleatórias na sequência de DNA do gene que codifica para a PpAzoR, quatro bibliotecas de mutantes foram criadas utilizando “error-prone PCR”. A identificação dos mutantes com aumento na estabilidade e/ ou na atividade foi feita através “high-throughput screening” em placas de 96 poços, através da medição da atividade enzimática antes e depois de uma incubação a temperaturas elevadas. Como resultado da aplicação destas metodologias aproximadamente 10.000 clones foram avaliados o que resultou na seleção de 20 variantes apresentando actividade enzimática e termoestabilidade superiores à enzima nativa. Através da sequenciação do DNA foram identificadas 18 mutações envolvidas na termoestabilidade da enzima, localizadas principalmente em loops, e uma (Y179H), perto da posição da zona de ligação do FMN, responsável pelo aumento verificado na atividade. O variante 13G10 contém 6 mutações, apresentando os valores mais elevados da termoestabilidade e de atividade relativamente à enzima nativa: 12 vezes mais estável e 2 vezes mais ativo. Os variantes obtidos constituem um ponto de partida adequado para o melhoramento da atividade enzimática ou para a evolução de uma enzima dependente de NADH.

Azo dyes are the major group of synthetic colorants used in industries and are serious environmental pollutants. PpAzoR is a FMN-dependent NADPH azoreductase from Pseudomonas putida MET94, able to decolourize several azo dyes to their corresponding aromatic amines, under anaerobic conditions. This property makes PpAzoR very attractive for the biological treatment of wastewaters, but its thermal stability is rather low (with a half life of 30 min at 40°C) representing a serious drawback for its biotechnological applications. In this study it is described the improvement of PpAzoR thermostability by implementing directed evolution approaches. Directed evolution has being reported as a useful tool for improving enzymatic properties. PpAzoR mutant libraries were generated using error-prone PCR and variants were grown in 96 well-plates. To identify hits with improved thermostability and/ or activity a high-throughput screening assay was developed and optimised based on enzymatic measurements before and after a heat treatment. Four rounds of error-prone PCR and high-throughput screenings (≈ 10,000 clones) yielded 20 improved hits. With DNA sequencing of the variants, 18 mutations were identified as being involved in the thermostability, mostly in protein loops, one single mutation, located close to the FMN binding site (Y179H) is most probably responsible for the increase in enzymatic activity. A variant with the highest improvements (13G10) showing a 12-fold higher thermostability and a 2-fold higher activity relative to the wild type, had 6 mutations. These variant obtained, are a suitable starting point for further evolution to improve activity or to engineer a PpAzoR NADH-dependent.