Micropropagação de Bupleurum spp. e avaliação da atividade anti-inflamatória dos seus óleos essenciais

Abstract

Algumas espécies do género Bupleurum L. contêm metabolitos secundários que apresentam atividade biológica e valor comercial. No entanto, apesar de apresentar grande diversidade, poucos estudos foram efetuados nas espécies deste género presentes em Portugal. O presente trabalho visa a valorização das espécies de Bupleurum que crescem espontaneamente em Portugal, estudando o potencial anti-inflamatório dos seus óleos essenciais e desenvolvendo protocolos de micropropagação in vitro de algumas espécies presentes na região da Beira Litoral. A extração dos óleos essenciais de B. rigidum subsp. paniculatum e B. lancifolium foi realizada através de hidrodestilação. A análise da atividade anti-inflamatória dos óleos essenciais de B. rigidum subsp. paniculatum e B. fruticosum foi realizada, utilizando várias concentrações (0,16-0,64 μl ml-1) de duas amostras de óleo essencial de B. fruticosum (BFI e BFII) e duas amostras de óleo essencial de B. rigidum subsp. paniculatum (BRI e BRII), avaliando o efeito destes na produção de NO e citotoxicidade em linhas celulares de macrófagos de rato (Raw 264,7) estimuladas por LPS. A cultura in vitro de B. rigidum subsp. paniculatum, B. gerardi e B. fruticosum foi estabelecida via proliferação de meristemas e embriogénese somática, utilizando o meio de cultura MS com diferentes concentrações de benzilamino-purina (BAP) e ácido 3-indol acético (IAA). A caracterização das estruturas secretoras foi efetuada com base em observações em microscopia ótica (MO) e microscopia eletrónica de varrimento (SEM) e as suas secreções analisadas a partir de testes histoquímicos. A hidrodestilação permitiu a extração do óleo essencial de partes aéreas floridas de B. rigidum subsp. paniculatum, no entanto, não foi possível isolar o óleo de partes aéreas em flor e frutos secos de B. lancifolium. Os resultados da atividade anti-inflamatória permitiram identificar o efeito inibitório na produção de NO da amostra BRI na concentração de 0,64 μl ml-1. Na micropropagação a adição de 1,0 mg l-1 de BAP e 0,5 mg l-1 IAA, ao meio de cultura MS, foi a mais eficiente na multiplicação de rebentos de B. rigidum subsp. paniculatum, em B. fruticosum a adição de 1,5 mg l-1 de BAP e 1,0 mg l-1 IAA permitiu a multiplicação dos explantes. O enraizamento das plântulas formadas foi possível após o cultivo durante 2 semanas em meio de cultura MS com 1,0 mg l-1 de ácido 3-indol butírico (IBA) e 2 semanas em meio de cultura sem reguladores de crescimento. A proliferação de meristemas de B. gerardi foi possível em meio de cultura com e sem a adição de BAP. No entanto, nesta espécie observou-se floração in vitro e a adição de BAP demonstrou ter um efeito positivo na floração dos explantes. A indução de embriogénese somática, através de secções foliares de plantas estabelecidas in vitro, realizou-se com base num protocolo constituído por duas fases: inicialmente massas pro-embriogénicas formaram-se em meio MS suplementado com 1,0 mg l-1 de ácido 2,4- ix diclorofenoxiacético (2,4-D), 0,2 mg l-1 de Cinetina (KN) e o desenvolvimento de embriões somáticos a partir destas ocorreu somente em meio de cultura sem reguladores de crescimento. A caracterização das estruturas secretoras permitiu identificar canais secretores em B. rigidum subsp. paniculatum, B. gerardi e B. fruticosum e a identificação de secretados terpénicos em plantas in vitro. Os resultados obtidos permitiram, pela primeira, vez identificar o efeito anti-inflamatório do óleo essencial de B. rigidum subsp. paniculatum, estabelecer culturas in vitro de B. rigidum subsp. paniculatum, B. gerardi e a proliferação via embriogénese somática de B. fruticosum. A identificação da presença de compostos terpénicos em plantas estabelecidas in vitro comprova a capacidade destas produzirem compostos desta natureza.

Some species of the genus Bupleurum L. contain secondary metabolites with biological activity and commercial value. However, despite the great biodiversity, few studies have been performed in species of this genus present in Portugal. This work aims to value species of Bupleurum growing spontaneously in Portugal by studying the anti-inflammatory potential of their essential oils and developing protocols for in vitro micropropagation of some species present in Beira Litoral region. The essential oil extraction of B. rigidum subps. paniculatum and B. lancifolium was performed by hydrodistillation. The anti-inflammatory activity of the essential oils of B. rigidum subsp. paniculatum and B. fruticosum was evaluated using different concentrations (0.16-0.64 μl ml-1) of two samples of B. fruticosum essential oil (BFI and BFII) and two samples of B. rigidum subsp. paniculatum essential oil (BRI and BRII), by testing their effect on NO production in a macrophages cell line (Raw 264.7) stimulated with LPS. In vitro cultures of B. rigidum subps. paniculatum, B. gerardi and B. fruticosum were evaluated by shoot proliferation and somatic embryogenesis, in MS culture medium supplemented with different concentrations of BAP and IAA. The secretory structures of these species were examined by LM and SEM and their secretion analyzed through histochemical tests. Hidrodistillation allowed the extraction of essential oils from the flowering aerial parts of B. rigidum subsp. paniculatum, but was unable to isolate the oils from the flowering aerial parts and dried fruits of B. lancifolium. The results of the anti-inflammatory activity showed that BRI at 0.64 μl ml-1 had an inhibitory effect on NO production. Regarding in vitro cultures, MS medium supplemented with 0.5 mg l-1 IAA and 1.0 mg l-1 BAP resulted in the best multiplication rate of B. rigidum subsp. paniculatum; in B. fruticosum the best results were achieved with the addition of 1.0 mg l-1 IAA and 1.5 mg l-1 BAP to the culture medium and root formation gave the best results in two weeks culture in MS medium supplemented with 1.0 mg l-1 IBA and two weeks culture in hormone-free medium. Shoot proliferation of B. gerardi was achieved in MS medium with or without BAP, however in this species, in vitro flowering was observed and the addition of BAP to the culture medium showed a positive effect in in vitro flowering. Somatic embryogenesis induction, using leaf sections of in vitro plantlets, was achieved in two steps: first the formation of proembryogenic masses ocurred in MS medium with 1.0 mg l-1 2.4-D and 0.2 mg l-1 KN and only after transfer to hormone-free medium the somatic embryos were formed. The secretory structures were identified as secretory ducts in several tissues of B. rigidum subps. paniculatum, B. gerardi and B. fruticosum and the histochemical tests revealed the presence of terpenic compounds in these structures. xi For the first time the anti-inflammatory effect of the essential oil of B. rigidum subps. paniculatum was identified and in vitro cultures of B. gerardi and B. rigidum subps. paniculatum were successfully established. Also, somatic embryogenesis induction in B. fruticosum was achieved and the identification of terpenic compounds in in vitro plantlets proved their capacity to produce essential oils in early stages of development.