The Plant Specific Insert (PSI) and its Molecular Role in Protein Sorting

Abstract

A particular characteristic of plant aspartic proteinases is the presence of an approximately 100 amino-acids long insertion, highly homologous to both saposins and saposin-like proteins and whose physiological function is currently unknown – the Plant Specific Insert (PSI). This PSI domain is characterized by a closely packed globular structure comprised by five amphipathic α-helices linked to each other by three disulfide bridges. This domain’s importance in vacuolar trafficking has already been demonstrated in transient expression experiments using tobacco protoplasts expressing a PSI-lacking phytepsin. However, additionally to the PSI’s involvement in protein sorting to the plant vacuole, this domain’s properties in inducing vesicle leakage in vitro has been demonstrated, a result that suggests plant aspartic proteinases might be bifunctional molecules, acting both as membrane-destabilizing agents and proteinases. Recently, a novel AP has been discovered in Chlamydomonas reinhardtii. Its characterization has revealed a series of intriguing features, such as an 80 amino-acid long alanine-rich insertion in the PSI domain, as well as a chloroplastidial subcellular localization, both of which had never been reported for typical aspartic proteases, turning this novel proteinase, chlapsin, into a most promising model for studying the molecular mechanisms associated with the PSI’s role in protein sorting. This study focused in the preparation of the molecular tools required for the study and characterization of this algae’s novel PSI domain, whose function in protein sorting is currently unknown, in particular the manipulation of PSI-focused mutant versions of the original chlapsin proteinase. A constant parallelism was maintained with cardosin A’s PSI domain, which has been demonstrated to be a vacuolar sorting determinant, in the attempt to understand the level of evolutionary conservation associated to these mechanisms. Recombinant cardosin A PSI was also purified and used in the search for putative binding partners in the native system, in the attempt to further our understanding about the unique molecular mechanisms associated to this unusual vacuolar sorting determinant.

Uma particularidade associada às proteinases aspárticas vegetais prende-se com a presença de uma inserção de aproximadamente 100 aminoácidos, que demonstra um elevado nível de homologia com proteínas pertencentes à família das saposinas, cuja função fisiológica ainda não foi completamente elucidada – o Plant Specific Insert (PSI). Este domínio caracteriza-se pela sua estrutura globular compacta, composta por cinco hélices-α anfipáticas unidas entre si por três pontes dissulfeto. A importância deste domínio no trânsito vacuolar foi já demonstrada em trabalhos de expressão transiente de moléculas truncadas da fitepsina, em protoplastos de tabaco. Apesar do seu envolvimento no direcionamento de proteínas para o vacúolo, Egas e colaboradores também demonstraram as propriedades deste domínio na despolimerização de membranas facilitando a libertação de conteúdos vesiculares in vitro, um resultado que parece apontar para uma bifuncionalidade inerente a estas proteases, capazes de atuar tanto como agentes desestabilizadores de membranas biológicas, como agentes proteolíticos. Mais recentemente uma nova protease aspártica foi descoberta na microalga Chlamydomonas reinhardtii. A sua caracterização revelou uma série de aspetos curiosos, como uma inserção rica em alaninas com aproximadamente 80 aminoácidos, no domínio do PSI, assim como a sua acumulação no cloroplasto, o que torna esta proteinase (chlapsina) num modelo interessante para o estudo dos mecanismos moleculares associados à função do PSI no direcionamento de proteínas. Este estudo focou-se na obtenção das ferramentas moleculares necessárias ao estudo e caracterização do domínio PSI desta nova proteinase, cuja função no direcionamento intracelular de proteínas ainda é desconhecida, através da manipulação de mutantes focados neste domínio. Um paralelismo constante entre a chlapsina e a cardosina A (cujo domínio PSI já foi comprovado como sendo um sinal de endereçamento vacuolar) foi mantido durante este trabalho, na tentativa de compreender o nível de conservação evolutiva associado a estes mecanismos, através da comparação entre os dois sistemas – alga e planta. O PSI recombinante da cardosina A foi também purificado e utilizado na procura de interatores presentes no sistema nativo, na tentativa de aprofundar o nosso conhecimento atual sobre os mecanismos moleculares associados a este sinal de endereçamento vacuolar, que se tem vindo a revelar tão único.