Phytoestrogens as Alternative to the Hormone Replacement Therapy in Menopause: Cellular and Mitochondrial Interactions

Abstract

Os sintomas associados à menopausa, que são na maioria dos casos desconfortáveis para as mulheres. As alterações hormonais observadas neste período podem aumentar a incidência de condições patológicas tais como doenças cardiovasculares, osteoporose, afrontamentos, entre outros. A terapia de substituição hormonal (TSH), baseada em 17β-estradiol (E2), é normalmente administrada às mulheres na menopausa para ultrapassar os sintomas associados a este período. Contudo, a TSH tem alguns efeitos secundários, nomeadamente o risco aumentado de cancro da mama. Fitoestrogénios (FE), compostos naturais que são estruturalmente semelhantes a E2, têm sido sugeridos como alternativa à TSH. Devido à sua semelhança com E2, os FE podem ter actividade estrogénica ou anti-estrogénica. Não obstante, os riscos e benefícios dos FE na saúde da mulher não estão ainda bem estabelecidos. O principal objectivo deste projecto foi identificar FE com baixa toxicidade mas, simultaneamente, capaz (es) de atenuar alguns sintomas conhecidos da menopausa, com especial enfase para os afrontamentos. Um screening inicial foi efectuado com os FE seleccionados (enterolactona, enterodiol, resveratrol e coumestrol) usando fracções mitocondriais de cérebro e fígado, assim como células em cultura. Observámos que o coumestrol e o resveratrol reduziram a peroxidação lipídica mitocondrial. Adicionalmente, verificou-se que o resveratrol diminuiu a actividade da ATP sintase e inibiu competitivamente o complexo I da cadeia respiratória mitocondrial. Os efeitos antioxidantes do coumestrol foram também verificados na linha celular HepG2, reduzindo a geração do anião superóxido mitocondrial na presença de rotenona, um inibidor do complexo I. Tendo por base a hipótese de “transporte deficiente de glucose”, que pretende explicar os mecanismos moleculares dos afrontamentos, investigámos em seguida a função do E2 e dos FE na expressão de GLUT-1 na barreira hematoencefálica (BHC). Com efeito, foi possível verificar que o conteúdo em GLUT-1 aumentou nos capilares do cérebro seis horas após a incubação com E2. Nós verificámos que esta modulação da expressão de GLUT-1 ocorre a via sinalização ao nível do receptor de estrogénio alfa. Dos FE testados, apenas o coumestrol aumentou a expressão de GLUT-1 de maneira semelhante a E2. Seguidamente, avaliámos os efeitos do coumestrol in vivo, através do recurso a dois modelos de rato para a menopausa: a ovariectomia e o tratamento com diepóxido 4-Vinilciclohexeno. Os nossos resultados mostraram que, tanto o coumestrol como o E2, melhoram a função mitocondrial, aumentando a actividade do complexo I, a respiração ao nível do estado 3 e o índice de controlo respiratório no cérebro. Além disso, a administração de coumestrol em ratos fêmea ovariectomizados reduziu o stress oxidativo e as variações de temperatura medidas durante 6h, sendo este último um processo de avaliação de afrontamentos. Em conclusão, os resultados obtidos nesta tese mostram que, apesar de alguns FE terem apresentado benefícios em vários indicadores relacionados com a menopausa, mostraram também toxicidade mitocondrial, enquanto outros dos FE testados não mostraram qualquer efeito nos parâmetros analisados. Por outro lado, o coumestrol demonstrou possuir a menor toxicidade in vitro e in vivo, com especial enfoque para a função mitochondrial. O coumestrol modulou a expressão de GLUT-1 de forma similar ao E2, reduzindo a variação de temperatura em ratos fêmea ovariectomizados. Os resultados destacam a necessidade de identificar a toxicidade mediada por FE em diferentes órgãos alvo, nomeadamente ao nível da mitocondria. Neste âmbito, o estudo toxicológico é importante quando se propõe o uso indiscriminado de FE na TSH.

The symptoms associated with menopause, which result from hormonal changes observed during this period, are most of the times disquieting for women. These hormonal variations lead to an increased incidence of different medical conditions such as hot flashes, cardiovascular diseases and osteoporosis, among others. Hormone replacement therapy (HRT), based in 17β-estradiol (E2), is conventionally administered to menopausal women in order to overcome the symptoms associated with menopause. However, HRT has some side effects, such as increased risk of breast cancer. Phytoestrogens (PE), plant-derived compounds that structurally mimic E2, have been suggested as alternatives to HRT. Due to their molecular resemblance with E2, PE can have estrogenic and/or antiestrogenic activity. Nevertheless, the risk and benefits of PE in women’s health are not yet well established. The main purpose of this project was to identify PE with low toxicity but able to attenuate some symptoms associtated to menopause, with a special focus on hot flashes. An initial screening of all selected PE (enterolactone, enterodiol, resveratrol and coumestrol) was performed by using isolated mitochondrial fractions from brain and liver and cells in culture. We observed that coumestrol and resveratrol reduced mitochondrial lipid peroxidation and that the latter decreased ATP synthase activity and competitively inhibited complex I of the mitochondrial respiratory chain. The antioxidant effects of coumestrol were also observed on the HepG2 cell line, reducing mitochondrial superoxide anion generation in the presence of the complex I inhibitor rotenone. Following the “impaired glucose delivery” hypothesis for hot flashes, we then investigated the role of E2 and PE in GLUT-1 expression at the blood-brain barrier (BBB). The GLUT-1 content increased in brain microvessels after six hours of incubation with E2. We observed that this modulation of GLUT-1 expression occurred through ERα signaling. From the PEs tested, only coumestrol increased GLUT-1 expression similarily to E2. We then evaluated the effects of coumestrol in vivo by using two menopausal rodent models: ovariectomy and 4-Vinylcyclohexene diepoxide (VCD) treatment. Our data showed that coumestrol, as E2, increased mitochondrial function by increasing complex I activity, state 3 and respiratory control ratio (RCR) in brain. Furthermore, coumestrol administration in ovariectomized (OVX) rats reduced oxidative stress and temperature variations in OVX rats measured in a 6 hours span, an approach to indirectly evaluate hot flashes. In conclusion, the results obtained from this thesis showed that although some of the PE had benefits in menopausal models, they also showed mitochondrial toxicity, while others had no effects for the parameters analyzed. On the other hand, coumestrol demonstrated the lowest toxicity in vitro and in vivo, especially regarding mitochondrial function. Also, coumestrol modulated GLUT-1 expression similarly to E2 and decreased the temperature variation in ovariectomized rats. The data highlight the need to identify PE-mediated toxicity in several target organs, namely regarding mitochondrial alterations. This should be important when proposing a widespread use of PEs in HRT.