ON THE REPROGRAMMING OF THE KREBS CYCLE IN HYPOXIC AND VHL-DEFICIENT CANCER CELLS

Abstract

As células cancerígenas reprogramam o seu metabolismo para manterem a síntese de macromoléculas e proliferarem em ambientes díspares, em particular hipoxia. Há muitos anos que têm vindo a ser reconhecido que as células cancerígenas restruturam o seu metabolismo como se estivessem expostas a condições de hipoxia. Esta reprogramação metabólica envolve um aumento da captação de glucose, uma elevação do fluxo glicolítico e ampla produção de lactato, o que reduz o catabolismo de glucose no ciclo de Krebs. Durante a última década, biólogos do cancro têm demonstrado que células cancerígenas contendo mutações oncogénicas específicas também dependem de glutamina para manter a atividade do ciclo de Krebs, e suportar uma proliferação aberrante. Estes estudos foram principalmente focados no oncogene Myc, e o papel de outros oncogenes e supressores de tumor na regulação do metabolismo da glutamina tem permanecido inexplorado até recentemente. Efetivamente, as células têm de produzir novo DNA, lípidos e proteínas para que possam dividir-se, e o ciclo de Krebs produz muitos dos precursores necessários para estes processos anabólicos, incluindo acetyl-CoA (para a síntese de ácidos gordos) e aspartato (para a síntese de pirimidinas). Desta forma, não é totalmente surpreendente que as células cancerígenas se esforcem para manter um ciclo de Krebs funcional. Contudo, o conhecimento é limitado no que toca ao metabolismo da glutamina, da sua regulação e significância em células cancerígenas e hipóxicas. Nesta dissertação doutoral, nós procurámos elucidar o papel biossintético da glutamina de forma a compreender a plasticidade metabólica de células cancerígenas hipóxicas e pseudo-hipóxicas. Nós identificámos a carboxilação redutiva (CR), a partir de glutamina, com a via principal para a síntese de lípidos em condições de hipoxia. Acetyl-CoA é o precursor para a síntese de lípidos e, em condições normais de oxigénio, é gerado a partir de piruvato vindo da glucose. Contudo, as células expostas a hipoxia inibem o fluxo de carbonos da glucose para o ciclo de Krebs e acetyl-CoA, surgindo a questão de como a lipogénese de novo poderá ser mantida em células em hipoxia. Usando marcadores isotópicos de carbono 13 e análises de espectrometria de massa, nós mostrámos que linhas celulares humanas em condições de hipoxia dependem da conversão de α-cetoglutarato em isocitrato (carboxilação redutiva, CR), mediada pela isocitrato desidrogenase 1 (IDH1), para manter a lipogénese de novo. Além disso, as células de carcinoma renal (CCR) que são deficientes no supressor de tumor von Hippel-Lindau (VHL) também dependem da reação CR para a síntese de lípidos mesmo a condições normais de oxigénio. Os HIF-1α/2α são fatores de transcrição que medeiam adaptações celular a hipoxia, e as células deficientes em VHL expressam HIF-1α/2α constitutivamente; isto é, independentemente da disponibilidade de oxigénio. Para investigar o papel do HIF e da sinalização subjacente à carboxilação redutiva, nós introduzimos várias proteínas mutantes de VHL em células CCR (deficientes em VHL) que diferem na sua capacidade de inativar HIF, e mostrámos que HIF é estritamente necessário para estimular a reação CR para a lipogénese de novo. A expressão de uma proteína HIF-2α mutante foi suficiente para induzir CR em células CCR previamente reconstituídas com a proteína VHL funcional. Nós demonstrámos que a carboxilação redutiva está ativa in vivo em tumores deficientes em VHL crescidos como xenógrafos em ratinhos, e mostrámos que as células deficientes em VHL são seletivamente sensíveis à privação de glutamina em condições in vitro e in vivo. A carboxilação redutiva é uma reação que depende de NADPH, onde este doa o anião hidreto (H-) que reduz o α-cetoglutarato em isocitrato. Neste contexto, a(s) fonte(s) de NADPH que contribuem para a reação CR não for investigadas anteriormente. Para tal, nós avaliámos a contribuição de NADPH mitocondrial gerado pela enzima nicotinamida nucleótido transidrogenase (NNT). NNT reside na membrana interna da mitocôndria e converte NADH em NADPH. Nós mostrámos que a diminuição da expressão de NNT em células SkMel5 e 786-O inibe a contribuição da carboxilação redutiva para a atividade do ciclo de Krebs, enquanto a sobre-expressão de NNT foi suficiente para estimular esta via. Estas observações foram suportadas por alterações nos rácios de NAD(P)H / NAD(P)+. Finalmente, nós investigámos o papel do HIF em células CCR na regulação da biossíntese de pirimidinas a partir de glutamina. A glutamina pode ser usada no ciclo de Krebs para gerar aspartato – a fonte de carbono para a síntese de pirimidinas. Usando marcadores de carbono 13, nós mostrámos que células CCR deficientes em VHL dependem do aspartato produzido pela carboxilação redutiva para manter a síntese de pirimidinas de novo. A inibição da glutaminase (GLS) reduziu os níveis intermediários das pirimidinas em células deficientes em VHL mas não em células reconstituídas com VHL funcional, sendo que as últimas utilizaram a oxidação de glucose mais eficientemente para alimentar a produção de aspartato. A dupla inibição das vias de novo e de reciclagem da síntese de pirimidinas inibiu seletivamente o crescimento das células deficientes em VHL, enquanto a adição de nucleósidos ao meio de cultura resgatou este efeito no crescimento celular. Nesta dissertação doutoral, nós elucidámos a reprogramação do ciclo de Krebs em células cancerígenas deficientes em VHL e em hipoxia. Em última instância, estes resultados classificam a carboxilação redutiva como um mecanismo de sobrevivência celular para a manutenção de biossíntese, e sugerem que a utilização de inibidores da GLS para suprimir esta via pleiotrópica de glutamina-para-biomassa (dependente de HIF) poderá ser uma estratégia terapêutica viável para tumores deficientes em VHL.