Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10316/18805
Title: Regulation of the Ras Pathway by Neurofibromin in Dendritic Spines
Authors: Oliveira, Ana Isabel Ferreira Martins de 
Orientador: Yasuda, Ryohei
Duarte, Carlos B.
Keywords: Neurofibromina; Células dentriticas; Plasticidade sináptica
Issue Date: 26-Mar-2012
Citation: OLIVEIRA, Ana Isabel Ferreira Martins de - Regulation of the Ras pathway by neurofibromin in dendritic spines = Regulação da via de sinalização Ras pela neurofibromina em espículas dendríticas [em linha]. Disponível em URL : http://hdl.handle.net/10316/18805. Coimbra : [s.n.], 2012
Abstract: Diversas evidências experimentais têm sugerido que a plasticidade sináptica desempenha um papel importante na formação de memórias e na aprendizagem. A via de sinalização da Ras é um elemento importante em muitas formas de plasticidade sináptica, incluindo a potenciação sináptica de longa duração (LTP) e a morfogénese das espículas dendríticas. Em consonância com a função da Ras na plasticidade sináptica, muitas doenças mentais que causam défices de aprendizagem estão associadas com o funcionamento anormal desta via de sinalização. A Neurofibromatose Tipo I (NF1) é uma dessas doenças, sendo causada por mutações que resultam na perda de função do gene Nf1, que codifica a neurofibromina, uma proteína inactivadora da Ras. Entre outros sintomas, 40 a 60% dos pacientes têm problemas de aprendizagem e memória. Apesar de já ter sido demonstrado que a neurofibromina está presente nas espículas dendríticas dos neurónios do hipocampo, a função da neurofibromina nas espículas dendríticas ainda não está bem estudada. Neste trabalho, investigámos o papel da neurofibromina na estabilidade de longa duração das espículas dendríticas, e a contribuição da Ras neste processo. A diminuição da expressão proteica da neurofibromina com “short-hairpin RNA” (NF1 shRNA) reduziu a densidade das espículas dendríticas nos neurónios piramidais da região CA1, em culturas organotípicas do hipocampo, sem perturbar outros aspectos da morfologia das espículas dendríticas. Este fenótipo resultou de um mecanismo dependente da sinalização pela Ras, uma vez que a co-expressão do domínio GAP (GRD; domínio inactivador da Ras) da neurofibromina juntamente com NF1 shRNA foi suficiente para restaurar a densidade normal de espículas dendríticas. Este fenótipo depende ainda da actividade neuronal, uma vez que não foi observada qualquer alteração na densidade das espículas quando a actividade neuronal foi suprimida nas preparações. O NF1 shRNA também diminuiu a frequência das “mini excitatory post-sinaptic currents” (mEPSCs), sugerindo que a neurofibromina é necessária para a manutenção da função normal das sinapses excitatórias. A manutenção da densidade normal de espículas dendríticas depende também da existência de mecanismos de plasticidade estrutural. Para determinar se a neurofibromina é necessária para a plasticidade estrutural das espículas dendríticas, analisámos o crescimento das espículas dendríticas associado com a LTP em neurónios onde a expressão proteica da neurofibromina foi reduzida com shRNA. Nestes ensaios, foi utilizada a estimulação “two-photon glutamate uncaging” numa única espícula dendrítica, um protocolo que induz um crescimento prolongado (~ 1 hora) das espículas dendríticas. Na presença do NF1 shRNA, este protocolo de estimulação induziu um efeito muito transitório no crescimento das espículas dendríticas. Este fenótipo foi abolido aquando da co-expressão do domínio GRD da neurofibromina, sugerindo a contribuição da sinalização pela Ras. A incubação da preparação com Mg2+ aboliu o fenótipo observado após a remoção de neurofibromina, indicando que o efeito desta proteína na plasticidade estrutural das espículas dendríticas é dependente da actividade neuronal. Para investigar se a neurofibromina regula a actividade da Ras em espículas dendríticas durante a plasticidade estrutural, monitorizou-se a actividade da Ras em espículas dendríticas estimuladas de modo a exibirem plasticidade estrutural, e a actividade da neurofibromina foi manipulada usando NF1 shRNA. Nestes ensaios, a actividade da Ras foi medida utilizando a “fluorescence lifetime imaging” (FLIM) e a estimulação das espículas foi efectuada através de “two-photon glutamate uncaging”. Observou-se que o declínio da activação da Ras foi muito mais lento em neurónios que expressavam NF1 shRNA. Pelo contrário, a sobre-expressão do domínio GRD da neurofibromina resultou num decréscimo da actividade basal da Ras, acompanhado por uma redução do pico da actividade durante a fase transitória da plasticidade estrutural, e acelerou a inactivação da Ras na resposta à estimulação de uma única espícula dendrítica. Estes resultados sugerem que a neurofibromina é uma das principais RasGAPs nas espículas dendríticas dos neurónios piramidais da região CA1 do hipocampo. No seu conjunto, a menor densidade de espículas dendríticas, a redução da plasticidade estrutural e a activação persistente da Ras nos neurónios com baixos níveis de expressão proteica de neurofibromina sugerem que esta proteína desempenha um papel importante na região pós-sináptica no hipocampo. Estes resultados podem explicar, pelo menos em parte, os défices cognitivos observados nos pacientes com NF1 e no modelo animal de NF1, assim como a redução na plasticidade sináptica observada no modelo animal de NF1. Além disso, o facto de os fenótipos observados nas espículas dendríticas serem abolidos quando a actividade da Ras é suprimida indica que a regulação rigorosa da via de sinalização da Ras é essencial para a estabilidade das espículas dendríticas e para a plasticidade estrutural, e poderá estar relacionada com o papel da neurofibromina na plasticidade sináptica, aprendizagem e memória. Por último, neste trabalho identificámos, pela primeira vez, uma proteína (neurofibromina) que actua como uma RasGAP nas espículas dendríticas e expandimos o conhecimento actual sobre a função da neurofibomina no cérebro.
Synaptic plasticity is thought to underlie learning and memory formation. The Ras pathway plays critical roles in many forms of synaptic plasticity, including long-term potentiation (LTP) and morphogenesis of dendritic spines. Consistent with the important roles of Ras in synaptic plasticity, many mental diseases that cause learning deficits are associated with abnormal Ras signaling. Neurofibromatosis Type I (NF1) is one of such diseases, being caused by loss-of-function mutations of the Nf1 gene, which encodes neurofibromin, a Ras inactivator protein. Among other symptoms, 40-60% of the patients show learning and memory disabilities. While it has been shown that neurofibromin is localized in dendritic spines of hippocampal neurons, the function of neurofibromin in dendritic spines is not well understood. Here, we show that neurofibromin-dependent Ras regulation has an important role in the long-term stability of dendritic spines. We found that downregulation of neurofibromin by short-hairpin RNA (NF1 shRNA) decreased the density of dendritic spines in CA1 pyramidal neurons, in organotypic slice cultures of the hippocampus, leaving other aspects of spine morphology unaffected. This phenotype was Ras-dependent, since co-expression of the GAP-related domain (GRD; Ras inactivator domain) of neurofibromin together with NF1 shRNA was sufficient to restore the normal spine density. Additionally, this phenotype was activity-dependent: when neurons were cultured under suppressed neuronal activity, NF1 shRNA did not decrease the spine density. NF1 shRNA also decreased the frequency of mini excitatory postsynaptic currents (mEPSCs), suggesting that neurofibromin is required for the maintenance of normal function of excitatory synapses. Normal spine structural plasticity is required to maintain spine density. To examine if neurofibromin is required for normal spine structural plasticity, we imaged spine enlargement associated with LTP in neurons in which neurofibromin was downregulated with shRNA. Previous studies showed that two-photon glutamate uncaging at single dendritic spines causes long-lasting (~ 1 hour) enlargement of dendritic spines. We found that dendritic spines of neurons expressing NF1 shRNA display a transient enlargement following stimulation, which decays rapidly. This phenotype was rescued when co-expressing the GRD domain of neurofibromin, suggesting that it is a consequence of increased Ras signaling. Also, incubation with Mg2+ abolished the phenotype, indicating that the effects of neurofibromin on spine structural plasticity are activity-dependent. To study whether neurofibromin regulates Ras activity in dendritic spines during spine structural plasticity, Ras activity was monitored in single dendritic spines undergoing structural plasticity in neurons in which neurofibromin activity was manipulated. Using a combination of fluorescence lifetime imaging (FLIM) and 2-photon glutamate uncaging, we observed that the decay of Ras activation was much slower in neurons expressing NF1 shRNA. In contrast, overexpression of GRD reduced the basal Ras activity, decreased the peak Ras activation during the transient phase of structural plasticity and accelerated Ras inactivation following single spine stimulation. Hence, these data suggest that neurofibromin is a major RasGAP in the dendritic spines of CA1 pyramidal neurons of the hippocampus. Taken together, the observed lower spine density, impaired structural plasticity and persistent Ras activation in the dendritic spines of neurons with reduced neurofibromin expression levels provide strong evidence for a role of neurofibromin at postsynaptic sites in the hippocampus and may explain, at least in part, the cognitive deficits observed in NF1 patients and in the NF1 animal model, as well as the synaptic plasticity impairments in NF1 animal models. Moreover, the fact that the dendritic spine phenotypes observed here under low levels of neurofibromin expression are rescued when Ras activity is decreased indicates that a precise regulation of the Ras pathway is essential for proper structural plasticity and spine stability, which might explain, at least in part, the effect of neurofibromin-dependent regulation of the Ras pathway in synaptic plasticity, learning and memory. Lastly, we identified, for the first time, a protein (neurofibromin) that acts as a major RasGAP in dendritic spines and extended the current knowledge on the neurofibromin function in the brain.
Description: Tese de doutoramento em Biologia, na especialidade de Biologia Celular, apresentada à Faculdade de Ciências da Universidade de Coimbra
URI: http://hdl.handle.net/10316/18805
Rights: openAccess
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