Excitotoxicidade em células granulares do cerebelo que expressam ataxina-3 mutante - relevância para a patogénese da doença de Machado-Joseph

Abstract

A doença de Machado-Joseph (DMJ), também conhecida por ataxia espinocerebelosa do tipo 3 (SCA3, do inglês ”spinocerebellar ataxia type 3”), é uma das nove doenças de poliglutaminas. A DMJ é causada por uma expansão do trinucleótido citosina-adenina-guanina (CAG) no gene ATXN3, que codifica para a proteína ataxina-3 (Atx3). O aparecimento dos sintomas surge quando a expansão de CAGs é superior a 51 repetições. A sequência de poliglutaminas localiza-se no terminal carboxílico e induz alterações na conformação da proteína Atx3 expandida, levando à forma ‘misfolded’ e à acumulação nuclear de inclusões ubiquitinadas. Apesar da expressão generalizada da proteína Atx3 mutante, a neurodegenerescência ocorre em áreas selectivas do cérebro humano, tais como os núcleos pontinos, o cerebelo, o núcleo dentado, a substância negra e o estriado, entre outras. Este estudo teve como objectivo avaliar o mecanismo excitotóxico associado ao processo de neurodegenerescência no cerebelo. O mecanismo de excitotoxicidade é causado pela sobre-activação dos receptores ionotrópicos do glutamato, nomeadamente os receptores NMDA (do inglês “N-methyl-D-aspartate”) e AMPA (do inglês “α-amino-3-(5-methyl-3-oxo-1,2-oxazol-4-yl) propanoic acid”) em culturas primárias de células granulares do cerebelo (CGC) infectadas com vectores lentivirais que codificam para Atx3 humana wild-type (ATX3 WT, com 27 glutaminas) ou mutante (ATX3 MUT, com 72 glutaminas) ou CGC obtidas de murganhos wild-type (CGC wild-type) e transgénicos (CGC transgénicas, que expressam Atx3 mutante com 135 glutaminas). A determinação da viabilidade celular permitiu observar um efeito citotóxico após exposição a NMDA ou AMPA em CGC ATX3 WT e CGC wild-type, que não foi potenciado pela expressão da Atx3 mutante. De modo a caracterizar o efeito excitotóxico observado após estimulação selectiva dos receptores NMDA, determinaram-se as alterações simultâneas dos níveis de cálcio intracelular e do potencial de membrana mitocondrial em célula única. As CGC infectadas com vectores lentivirais para ATX3 WT ou ATX3 MUT induziram aumentos semelhantes dos níveis de cálcio intracelular e uma manutenção do potencial de membrana mitocondrial (avaliado pela libertação para o citosol da sonda TMRM+) após o estímulo inicial de NMDA/glicina. Contudo, a expressão de ATX3 MUT (com 72 glutaminas) aumentou a capacidade da mitocôndria em armazenar cálcio, associado a uma maior despolarização da membrana mitocondrial, comparativamente à ATX3 WT. Porém, as CGC isoladas de murganhos transgénicos apresentaram uma diminuição dos níveis de cálcio intracelular (provavelmente associado a uma diminuição da capacidade de activação dos receptores) e uma ligeira diminuição do potencial mitocondrial (avaliado pela pequena diferença na libertação citosólica de TMRM+) 6 após o estímulo de NMDA/glicina, comparativamente às CGC wild-type. De acordo com o decréscimo na entrada de cálcio após abertura dos receptores NMDA, ocorreu uma diminuição na captação de cálcio mitocondrial e, consequentemente, um maior potencial mitocondrial (maior retenção da sonda TMRM+) nas CGC transgénicas, relativamente às CGC wild-type. Em suma, os dois modelos de culturas de CGC usados sugerem alterações dos níveis de cálcio citosólico e função mitocondrial na resposta ao estímulo excitotóxico após a expressão da Atx3 mutante. Estes resultados sublinham a importância da realização de estudos adicionais para avaliar a função mitocondrial na DMJ num contexto celular, a fim de clarificar o papel do processo excitotóxico na patogénese da DMJ. Palavras-chave: Poliglutaminas; doença de Machado-Joseph; células granulares do cerebelo; excitotoxicidade; receptores ionotrópicos do glutamato