Impact of chronic stress on astrocytic K+ channels, Kir4.1, and their interactions with AQP4 channels: modulation by adenosine A2A receptors.

Abstract

O stress desencadeia respostas compensatórias que resultam na liberação de glicocorticoides através do eixo hipotálamo-pituitária-adrenal. Em casos de stress crónico, o aumento de glicocorticoides por um longo período pode desencadear sintomas comportamentais e neuropsiquiátricos, incluindo ansiedade, depressão, défice na concentração e nas funções executivas, deterioração cardiovascular e neurovascular, e complicações metabólicas. Estas alterações, em resposta ao stress, afetam a função das células gliais, em particular dos astrócitos. Alterações morfológicas e funcionais nos astrócitos, associadas à reatividade astrocítica, são consideradas uma característica patológica comum de vários distúrbios neurológicos. Os astrócitos são um dos tipos celulares mais abundante no Sistema Nervoso Central (SNC), e podem estar em contato próximo com terminais neuronais, vasos sanguíneos ou outras células gliais, desempenhando diversas funções no SNC, incluindo a manutenção da homeostase da água, a eliminação de resíduos celulares, através do sistema glinfático, e também o tamponamento do K+. O canal retificador interno de potássio (Kir4.1) e o canal de água aquaporina 4 (AQP4) são proteínas astrocíticas envolvidas nos fluxos de K + e de água, respetivamente. Evidências mostram que estes canais podem estar co-localizados em processos astrocíticos e que são afetados em condições de stress. Além disso, estudos anteriores mostraram que o bloqueio dos recetores de adenosina A2A (A2AR) atenuam modificações comportamentais em modelos animais sujeitos a stress crónico. No entanto, é necessário definir se e como as condições patológicas relacionadas com o stress afetam os níveis dos canais astrocíticos AQP4 e Kir4.1, se estes canais interagem entre si, e ainda, se as supostas interações funcionais entre esses dois canais são moduladas pelos A2AR.Neste estudo, através de experiências in vivo e in vitro, pretendemos investigar as complexidades das interações entre os canais Kir4.1 e AQP4 presentes em astrócitos. Para isso, expusemos astrócitos em cultura a dexametasona (Dexa), um glicocorticoide sintético que mimetiza condições de stress, para avaliar se existem alterações na densidade e na função dos canais AQP4 e Kir4.1 em condições que mimetizam condições patológicas de stress (ou seja, altos níveis de stress). Paralelamente, induzimos comportamentos do tipo ansioso num modelo de rato adulto Wistar, através de um protocolo de stress de imobilização por 14 dias, e posteriormente avaliámos as densidades dos canais AQP4 e Kir4.1; por Western-blot, em gliossomas (membranas de processos de astrócitos) do hipocampo, do córtex frontal e do córtex. Além disso, outro objetivo da nossa investigação centrou-se na avaliação do papel dos A2AR na regulação dos níveis destes canais, recorrendo a um antagonista seletivo dos A2AR, SCH58261, em células cultivadas expostas a Dexa para imitar condições de stress Procurando compreender as ligações potenciais entre a atividade dos astrócitos e distúrbios relacionados com o stress, os nossos resultados indicam que os astrócitos, em cultura, expostos a Dexa exibem um aumento nos níveis dos Kir4.1, que refletem as alterações nos níveis de Kir4.1 (aumento) observados nos gliossomas obtidos do hipocampo e do córtex frontal de ratos submetidos a stress de imobilização por contenção prolongada. Também investigamos a relação entre os canais de potássio Kir4.1 e os canais de água AQP4 nos astrócitos em cultura; e constatou-se que existe uma dependência unilateral relativamente aos seus níveis proteicos, tendo-se observado que os canais Kir4.1 podem controlar a expressão dos canais AQP4, mas os canais AQP4 não afetam os níveis dos Kir4.1. Além disso, o bloqueio dos A2AR sugere existir uma proteção contra a redução dos níveis de AQP4, que ocorre devido à inibição dos Kir4.1 via fluoxetina, um antidepressivo amplamente utilizado do tipo inibidor seletivo da recaptação da serotonina. Foi ainda estudado se alterações na concentração intracelular de Ca2+ (Δ[Ca2+]i) desencadeadas pela ativação dos AQP4, induzida por uma solução hiposmótica, são afetadas pelo inibidor dos Kir4.1 para perceber se existe uma interação funcional entre estes canais em condições que mimetizam o stress, causadas pela exposição a Dexa.Em conjunto, os nossos resultados mostram que, em condições de stress, existe uma interação entre os A2AR, os Kir4.1 e os AQP4 nos astrócitos, fornecendo novas evidências sobre os processos moleculares que medeiam as respostas dos astrócitos ao stress. Demonstrámos ainda que, num modelo de stress in vivo, os canais Kir4.1 também são afetados. Assim, através do estudo destas conexões moleculares, podemos estar no caminho certo para descobrir um possível alvo terapêutico para distúrbios neuropsiquiátricos relacionados com as respostas ao stress prolongado ou patológico.

Stress triggers compensatory responses that ultimately result in the release of glucocorticoids by the hypothalamic-pituitary-adrenal axis. In cases of chronic stress, these increase of glucocorticoids for a long period of time, can lead to behavioural, and neuropsychiatric symptoms, including anxiety, depression, challenges with focus and executive functions, cardiovascular and neurovascular deterioration, and metabolic complications. These alterations, brought on by the stress response, affect function of glial cells, in particular of astrocytes. Morphological and functional changes in astrocytes, associate with astrocytic reactivity, are considered a common pathological feature of several neurological disorders. One of the most abundant cells in the Central Nervous System (CNS) is the astrocytes that can be in tightly contact with neuronal terminals, blood vessels, and other glial cells. Astrocytes play diverse roles in CNS. including the maintenance of waste clearance and water homeostasis, through the glymphatic system, and also the buffering of K+. The potassium inward rectifying channel (Kir4.1) and the water channel aquaporin 4 (AQP4) are astrocytic proteins involved in K+ and water fluxes, respectively. There are evidence showing that these channels can be co-localized in astrocytic processes and are affected in stressful conditions. Moreover, previous studies showed that adenosine A2A receptors (A2AR) blockade attenuate behavioural modifications in animals exposed to repeated stress. However, it remains to be defined if and how stress- stress-related pathological conditions affect astrocytic AQP4 and Kir4.1 channels levels, and if these channels interact with each other, and if the putative functional interactions between these two channels are modulated by A2AR. In this study, taking advantages of both in vivo and in vitro experiments, we aim to investigate the complexities of Kir4.1 and AQP4 dynamics in astrocytes. For that, we exposed cultured astrocytes to dexamethasone (Dexa), a synthetic glucocorticoid that can mimic life-stress conditions, to assess if there are alterations in AQP4 and Kir4.1 densities and function under stress-like conditions. In parallel, we induced anxiety-like behaviours in a Wistar rat model, through a protocol of restrained stress for 14 days, and then the levels of AQP4 and Kir4.1 were measured by Western-blot, in gliosomes (membrane astrocytic processes) of hippocampus, frontal cortex, and cortex. Furthermore, another aim of our investigation was centred on study the role of A2AR in regulating AQP4 and Kir4.1 levels, resorting to a selective A2AR antagonist, SCH58261, in cultured cells exposed to Dexa to mimic stress-like conditions. stressed neural environment. Seeking to understand potential links between astrocyte activity and stress-related disorders, our data indicate that Dexa-exposed astrocytes exhibited a marked increase in Kir4.1 levels, which mirror the changes in Kir4.1 levels (increase) observed in gliosomes obtained from hippocampus and frontal cortex of rats subjected to prolonged restrained stress. We also investigate the relationship between potassium channels Kir4.1 and water-channels AQP4 in cultured astrocytes; and it was found out that exists a unilateral dependence in terms of their expression levels, being observed that Kir4.1 channels can control the expression of AQP4 channels, but the AQP4 channels cannot affect the levels of Kir4.1. Furthermore, A2AR blockade may offer protection against the reduction in AQP4 levels, a consequence of Kir4.1 inhibition via fluoxetine, a widely use antidepressant of selective serotonin reuptake inhibitor type. Moreover, it was investigated if changes in intracellular Ca2+ concentration (Δ [Ca2+]i) triggered by AQP4 activation, induced by an hypoosmotic solution, are affected by the inhibitor of Kir4.1, fluoxetine,; in order to assess a putative functional interaction between these channels under stress-like conditions, mimic by Dexa exposure. Overall, the gathered data showed that, in stress-like conditions, there is an interaction between A2AR, Kir4.1, and AQP4 in astrocytes, providing insights about the molecular processes behind the stress responses by astrocytes. We also observed, that in an in vivo model of stress, the Kir4.1 channels are affected. Thus, by exploring these molecular connections, we might contribute to reveal a possible therapeutic target for neuropsychiatric disorders relative with pathologic or prolonged stress.