IDENTIFICAÇÃO DE BIOMARCADORES DE PROGNÓSTICO EM ONCOLOGIA ATRAVÉS DA CARACTERIZAÇÃO GENÓMICA E EPIGENÉTICA

Abstract

O cancro oral e o cancro do reto são causas significativas de morbilidade e mortalidade em todo o mundo. Apesar da investigação científica exaustiva, ainda não foram identificados biomarcadores de prognóstico validados para estes tipos de cancro. Este estudo teve como objetivo identificar potenciais biomarcadores de prognóstico através da caracterização genómica e epigenética de amostras tumorais provenientes de doentes com cancro oral e cancro do reto. O estudo visou, também, caracterizar a linha celular WiDr, derivada de um adenocarcinoma colorrectal, como um modelo potencial para a investigação do cancro do reto. Adicionalmente, a quantificação de DNA livre (cfDNA) obtido a partir de biópsias líquidas foi explorada como potencial biomarcador de prognóstico e progressão no cancro oral. A análise da coorte do cancro oral envolveu a quantificação e análise de cfDNA extraído da urina e do plasma em vários momentos durante e após o tratamento, correlacionando-o com as características clínicas dos doentes. O perfil genómico e epigenético das amostras de tumores orais foi estabelecido utilizando as técnicas de Array Ccomparative Genomic Hybridization (aCGH) e de Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MS-MLPA). Os resultados revelaram aumentos significativos dos níveis de cfDNA após o tratamento, em comparação com os níveis basais, seguidos de diminuições subsequentes ao longo do tratamento. Alguns doentes com recidiva/metástases apresentaram níveis elevados de cfDNA após o tratamento. A análise por MS-MLPA identificou os genes MLH3 e GTSP1 como frequentemente amplificados, enquanto os genes CDKN2A e VHL foram os mais frequentemente deletados. O gene WT1 mostrou uma alta frequência de metilação. A análise por aCGH revelou ganhos frequentes no número de cópias nos cromossomas 3p, 14q e 15q, e perdas frequentes nos cromossomas 5q, Xp, 3p e 4p. Na análise preliminar da coorte de cancro do reto, os níveis basais de cfDNA foram avaliados em amostras de plasma, tendo sido observada uma grande discrepância entre os doentes. A análise por aCGH das amostras de tumores do reto revelou ganhos recorrentes em 13q e 20q, consistentes com estudos anteriores sobre cancro colorrectal. Tentou-se estabelecer culturas celulares primárias a partir de tecido tumoral do reto, o que foi dificultado devido ao crescimento excessivo de fibroblastos, sendo necessário ainda algumas optimizações. A caracterização da linha celular WiDr através de Citogenética Convencional demonstrou triploidia e vários rearranjos estruturais, nomeadamente del(4)(q32.1), der(5)t(5;13)(p15.3;q12), der(13;13)(q10;q10) e del(X)(p11.3). Será necessário complementar a caracterização molecular desta linha celular com outras técnicas como a Fluorescence In Situ Hybridization (FISH). Além disso, a análise por aCGH da linha celular WiDr revelou ganhos em 13q e 20q, concordantes com os achados em doentes com cancro do reto. Este estudo fornece informações valiosas sobre a utilidade da quantificação do cfDNA para monitorizar a progressão do cancro oral e identifica características genómicas e epigenéticas frequentes no cancro oral. Além disso, abre caminho a uma caracterização molecular mais abrangente dos doentes com cancro do reto e a uma investigação mais aprofundada da linha celular WiDr, de modo a identificar potenciais biomarcadores de prognóstico para o cancro do reto.

Oral cancer and rectal cancer are significant causes of morbidity and mortality worldwide. Despite extensive research, validated prognosis biomarkers for these cancers remain elusive. This study aimed to identify potential prognosis biomarkers through genomic and epigenetic characterization of tumour samples from oral cancer patients and rectal cancer patients. This study also aimed to characterize the WiDr cell line, derived from colorectal adenocarcinoma, as a potential model for rectal cancer research. Liquid biopsy-based quantification of cell-free DNA (cfDNA) was explored as a potential prognostic and progression biomarker in oral cancer. The oral cancer cohort analysis involved quantifying and analyzing cfDNA extracted from urine and plasma at various time points during and after treatment, correlating it with the patients´clinical characteristics. Genomic and epigenetic profiling of oral tumour samples was performed using Array Comparative Genomic Hybridization (aCGH) and Methylation-Specific Multiplex Ligation-Dependent Probe Amplification (MS-MLPA) techniques. The results revealed significant post-treatment increases in cfDNA levels compared to baseline, followed by subsequent decreases during treatment. Some patients with recurrence/metastasis exhibited elevated cfDNA levels post-treatment. MS-MLPA analysis identified MLH3 and GTSP1 as genes with frequent copy number gains, while CDKN2A and VHL exhibited frequent copy number losses. The WT1 gene showed frequent methylation. The aCGH analysis revealed frequent copy number gains on chromosomes 3p, 14q, and 15q, and frequent losses on chromosomes 5q, Xp, 3p, and 4p. In the preliminary analysis of the rectal cancer cohort, baseline cfDNA levels were measured in plasma samples, and a great discrepancy was observed between the patients. The aCGH analysis of rectal tumour samples revealed recurrent gains in 13q and 20q, consistent with previous colorectal cancer studies. Primary cell cultures from rectal tumour tissue were attempted but hampered by excessive fibroblast growth, and some optimization is still required. Characterization of the WiDr cell line through Conventional Cytogenetics demonstrated triploidy and structural rearrangements, such as del(4)(q32.1), der(5)t(5;13)(p15.3;q12), der(13;13)(q10;q10) e del(X)(p11.3). It will be necessary to further complete the molecular characterization of this cell line with other techniques such as Fluorescence In Situ Hybridisation (FISH). Additionally, aCGH analysis of the WiDr cell line revealed gains in 13q and 20q, mirroring findings in rectal cancer patients. This study provides valuable insights into the utility of cfDNA quantification for monitoring oral cancer progression and identifies frequent genomic and epigenetic characteristics in oral cancer. Moreover, it paves the way for comprehensive molecular characterization of rectal cancer patients and further investigation of the WiDr cell line, to identify potential prognosis biomarkers for rectal cancer.