The Role of a Candidate microRNA in Mitochondrial Dysfunction and Inflammatory Responses in vitro: Relevance to Parkinson's Disease

Abstract

A Doença de Parkinson (DP) é a segunda doença neurodegenerativa mais comum e é caracterizada pela perda acentuada de neurónios dopaminérgicos na Substantia Nigra pars compacta (SNpc) e pela presença de inclusões proteicas intracitoplasmáticas denominadas de Corpos de Lewy. A DP é diagnosticada aquando do surgimento dos primeiros sintomas motores, nomeadamente bradicinesia, tremor em repouso, rigidez muscular e instabilidade postural. Atualmente, acredita-se que o início dos sintomas motores é precedido por uma fase prodrómica, durante a qual surgem sintomas não motores, como a disfunção gastrointestinal. Embora a neuropatologia da DP seja bem compreendida, a sua etiologia permanece um mistério. Foi proposto que a DP inicia no sistema nervoso entérico e se espalha, através do nervo vago, para o sistema nervoso central. Além disso, tanto a inflamação a nível cerebral como a nível intestinal têm sido associadas à DP, conduzindo à hipótese de que o sistema imunológico desempenha um papel ativo na patogénese da DP. Adicionalmente, vários estudos descreveram que a microbiota intestinal está alterada em doentes com DP, o que poderá comprometer a integridade da barreira intestinal e aumentar a sua permeabilidade. Além disso, vários estudos detetaram uma expressão alterada de microRNAs (miRNAs) em doentes com DP, bem como sua capacidade de modular e serem regulados pela microbiota intestinal do hospedeiro. Curiosamente, um estudo recente mostrou um enriquecimento do miRNA-486-5p em biópsias de cólon de doentes com DP. Alguns estudos sugerem que os miRNAs podem ser usados como biomarcadores para o estudo de malignidade intestinal em amostras de fezes e tecidos. Além disso, a identificação de perfis diferenciais de miRNAs, quer em amostras de intestino, quer em amostras fecais, entre doentes e controlos saudáveis, também sugere que os miRNAs poderão ser usados como potenciais biomarcadores para a deteção da DP na fase prodrómica. Trabalhos anteriores do nosso grupo mostraram que a desregulação da função mitocondrial é um dos principais contribuintes para o desenvolvimento da DP. Além disso, vários estudos têm descrito um papel crucial das mitocôndrias na regulação e ativação de respostas inflamatórias. Considerando estas linhas de evidência, a presente tese tem como objetivo compreender se a expressão do miR-486-5p poderá contribuir para a patogénese da DP, afetando a função mitocondrial e ativando respostas inflamatórias. Os efeitos in vitro foram estudados através da transfeção de células Caco-2 (para mimetizar células intestinais) e células SH-SY5Y (para mimetizar neurónios da DP) com o miRNA mencionado. Os nossos resultados demonstraram um aumento dos níveis de marcadores inflamatórios em ambas as linhas celulares. Além disso, nas células Caco-2, os nossos resultados sugerem que a expressão de miR-486-5p pode levar ao comprometimento da barreira intestinal; nas células SH-SY5Y observamos a depleção de cardiolipina e consequente aumento de espécies reativas de oxigénio. No geral, podemos concluir que o miR-486-5p contribui para a inflamação intestinal e aumento da permeabilidade da barreira intestinal nas células Caco-2, enquanto nas células SH-SY5Y conduz à ativação de respostas inflamatórias devido à disfunção mitocondrial. Este estudo abre caminho para elucidar a contribuição de miRNAs específicos para a inflamação e disfunção mitocondrial no desenvolvimento da DP.

Parkinson’s Disease (PD), the second most common neurodegenerative disorder, is characterized by the severe loss of dopaminergic neurons in the Substantia Nigra pars compacta (SNpc) and by the presence of intracytoplasmic proteinaceous inclusions called Lewy Bodies. PD is clinically diagnosed upon the onset of characteristic motor symptoms, such as bradykinesia, resting tremor, rigidity, and postural instability. It is currently accepted that the onset of motor symptoms is preceded by a prodromal phase, during which non-motor features emerge, such as gastrointestinal dysfunction. Although the neuropathology of PD is fairly well understood, its aetiology remains a mystery. It has been proposed that PD might start in the enteric nervous system and spread, via the vagus nerve, to the central nervous system. Moreover, both brain and intestinal inflammation have been associated with PD, leading to the hypothesis that the immune system plays an active role in PD pathogenesis. Furthermore, several studies have reported that gut microbiota is altered in PD patients, in a way that compromises the integrity of the intestinal barrier and increases its permeability. Additionally, several studies have detected an altered expression of microRNAs (miRNAs) in PD patients, as well as their ability to modulate and be regulated by the host’s gut microbiota. Notably, a recent paper showed an enrichment of submucosal miRNA-486-5p in colon tissue from sporadic PD patients when compared to healthy age-matched controls. Interestingly, some studies suggested that miRNAs can be used as potential biomarkers for screening intestinal malignancy in stool and tissue samples. Moreover, in the future, identifying differential miRNA signatures either in intestine samples or in faecal samples between patients and healthy controls also suggest that miRNAs can be used as potential biomarkers for PD screening in a prodromal phase. Previous work from our group showed that dysregulation of mitochondrial function is a major contributor towards PD development. Moreover, several studies have now described a crucial role for mitochondria in the regulation and activation of inflammatory responses. Taking all these evidence into account, this thesis aims to investigate if miR-486-5p expression could contribute to PD pathogenesis by affecting mitochondrial function and activating inflammatory responses. In vitro effects were studied by transfecting Caco-2 cells (to mimic intestinal cells) and SH-SY5Y cells (to mimic PD neurons) with the mentioned miRNA. Our results demonstrated increased inflammatory markers levels in both Caco-2 and SH-SY5Y cells. Furthermore, our findings from Caco-2 cells propose that up-regulation of miR-486-5p could ultimately lead to the impairment of the intestinal barrier; in SH-SY5Y cells, we observed the depletion of cardiolipin and consequent increase of ROS. Overall, we can conclude that miRNA-486-5p contributes to gut inflammation and loss of the gut barrier integrity in Caco-2 cells whereas in SH-SY5Y cells leads to the activation of inflammatory responses due to mitochondrial dysfunction. This study paves the way to clarify the contribution of specific miRNAs in inflammation and mitochondrial dysfunction in PD development.