MOLECULAR DIAGNOSIS OF NEUROFIBROMATOSIS TYPE I AND OTHER RASOPATHIES

Abstract

Introduction: The RASopathies are a group of genetic disorders, caused by germline pathogenic variants in one of the constituents of the RAS/mitogen-activated protein kinase (RAS/MAPK) signalling pathway. To date, approximately 20 genes have been associated with RASopathies, including neurofibromatosis type I (NF1), and it is one of the largest groups of malformation syndromes with overlapping features. Neurofibromatosis type I has an incidence of between 1 in 2500 to 1 in 3000 individuals and is an autosomal dominant disorder. It's mainly characterized by multiple café-au- lait macules (CALMs), cutaneous and subcutaneous neurofibromas (cNFs and sNFs), iris hamartomas (Lisch nodules), freckling of axillary and inguinal regions and plexiform neurofibromas (pNFs). NF1 is a disease caused by loss-of-function variants in the neurofibromin 1 gene, a tumor suppressor gene. More than 4000 pathogenic variants are reported in the HGMD® Professional and around 30% of the pathogenic NF1 DNA variants affect the splicing event. NF1 encodes neurofibromin a Ras-guanosine triphosphatase (GTPase) activating protein (RAS-GAP) that acts as a negative regulator of RAS protein. Molecular testing of NF1 is difficult because it's a large gene, there is no mutation hotspot, and a significant number that of variants that affects splicing are not easily detected. This approach should include analysis of both genomic DNA (gDNA) and complementary DNA (cDNA). NF1 has many clinical features that affect different parts of the body and surgical removal is the main treatment.Objectives: 1) Learning, familiarization, and acquisition of technical skills in the molecular techniques. 2) To learn and acquire of technical skills in the classification of genetic variants. 3) To complete the process implementing a protocol for the molecular study of NF1 at the Unidade Funcional de Hematologia Molecular – Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (UFHM). 4) Performing molecular diagnosis in patients with clinical suspicion of NF1. 5) Development of a next-generation sequencing panel (NGS) for RASopathies.Materials and Methods: In this study, 40 individuals, from 34 unrelated families with NF1 clinical suspicion were studied. The sequential study of NF1 developed at UFHM starts with the study of the coding region by NGS, proceeds to the study of copy number variations (CNV) by multiplex ligand probe amplification (MLPA) assay and ends with cDNA analysis. Patients with negative results for NF1 (gDNA and cDNA) should be included in the RASopathies study for differential diagnosis of NF1.Results and Discussion: Nineteen different variants have been identified in NF1, in 20 of 34 probands, four of which were novel (c.5692dup, c.2614G>T, c.1392+751T>G, c.(3974+10_3982)_(6250_6387)del). Sixty-one percent of the pazents were posizve for NF1 and 39% were negazve. The NGS study revealed 16 different variants, one large deletion was found by MLPA, and cDNA Sanger sequencing allowed the identification of one deep intronic variant and the confirmation of the splice variant previously identified (skipping of exon 31 was detected). Six variants, including two of the novel variants (c.2614G>T and c.1392+751T>G), were classified according to the NF1 splicing variant classification system, based on their effect on the splicing event. No new phenotype- genotype correlations were found. Of the 14 NF1-negative patients, six could be investigated for the differential diagnosis of RASopathies by whole exome sequencing (WES) using a virtual RASopathies panel. Among of the six patients studied by WES, in four cases gene defects were found: in two patients, two novel likely pathogenic variants were identified, c.1769A>G in SOS1 and c.410C>A in LZTR1, genes associated with Noonan syndrome; in the other two patients, were identified two gross deletions in MAP2K2 and in HRAS.Conclusion: This two-step strategy proved to be highly efficient, as the combination of three different and complementary methods (gDNA and cDNA sequencing, and MLPA) it was able to identify 19 different variants, four of which had not been previously described. The addition of cDNA sequencing to the diagnostic algorithm was fundamental to understanding the impact of DNA variants on NF1 mRNA. For a better and correct evaluation of the sensitivity of this study, the differential diagnoses of NF1 in all the negative patients should be excluded and more individuals should be studied.

Introdução: As RASopatias são um grupo de síndromes genéticas, causadas por variantes patogénicas na linha germinativa num dos constituintes da via de sinalização RAS/mitogen-activated protein kinase (RAS/MAPK). Até à data, cerca de 20 genes foram associados a RASopatias, que incluem a neurofibromatose tipo I (NF1), e é um dos maiores grupos de síndromes de malformação com características clínicas comuns. A neurofibromatose tipo I tem uma incidência entre 1 em 2500 a 1 em 3000 indivíduos e é uma doença autossómica dominante. Caracteriza-se principalmente por múltiplas manchas “café-com-leite” (CALMs), neurofibromas cutâneos (cNFs) e subcutâneos (sNFs), harmatomas da iris (nódulos de Lisch), sardas na região axilar e inguinal e neurofibromas plexiformes. NF1 é causada por variantes de perda de função no gene neurofibromin 1, um gene supressor tumoral. Mais de 4000 variantes patogénicas estão reportadas no HGMD® Profissional e cerca de 30% das variantes patogénicas encontradas no NF1 afetam o splicing. NF1 codifica a neurofibromina, uma proteína ativadora de Ras-guanosine triphosphatase (GTPase), que regula negativamente a proteína RAS. O estudo molecular de NF1 não é fácil, uma vez que, é um gene grande, sem “hotspot” e com um elevado número de variantes que alteram o splicing e que não são facilmente detetadas. Esta abordagem deve incluir a análise do DNA genómico (gDNA) e do DNA complementar (cDNA). NF1 tem inúmeras manifestações clínicas que afetam diferentes partes do corpo, sendo a remoção por cirurgia o principal tratamento.Objetivos: 1) Aprendizagem, familiarização e aquisição de competência técnica na utilização das técnicas de biologia molecular. 2) Aprender e adquirir competências técnicas na classificação de variantes genéticas. 3) Completar o processo de implementação de um protocolo para o estudo molecular de NF1 na Unidade Funcional de Hematologia Molecular - Centro Hospitalar e Universitário de Coimbra (UFHM). 4) Realização de diagnóstico molecular em doentes com suspeita clínica de NF1. 5)Desenvolvimento de um painel de sequenciação de nova geração (NGS) para RASopatias.Materiais e Métodos: Neste trabalho, foram estudados 40 indivíduos, de 34 famílias diferentes, com suspeita clínica de NF1. O estudo sequencial de NF1 desenvolvido na UFHM inicia-se com o estudo da região codificante por NGS, seguindo para o estudo de copy number variation (CNV) por multiplex ligand probe amplification (MLPA) e finalizando com a análise do cDNA. Os doentes com resultados negativos para NF1 (gDNA e cDNA) devem ser incluídos no estudo das RASopatias para diagnóstico diferencial de NF1.Resultados e Discussão: Foram identificadas 19 variantes diferentes, em 20 de 34 probandos, quatro das quais novel (c.5692dup, c.2614G>T, c.1392+751T>G, c.(3974+10_3982)_(6250_6387)del). Sessenta e um por cento dos doentes foram positivos para NF1 e 39% foram negativos. O estudo NGS revelou 16 variantes diferentes, uma grande deleção foi encontrada por MLPA e a sequenciação de Sanger do cDNA permitiu a identificação de uma variante deep intrónica e a confirmação da variante de splice previamente identificada (foi detetado o skipping do exão 31). Seis variantes, incluindo duas das novas variantes (c.2614G>T and c.1392+751T>G), foram classificadas segundo o sistema de classificação de variantes de splicing de NF1, com base no seu efeito no evento de splicing. Não foram encontradas novas correlações fenótipo-genótipo. Dos 14 doentes negativos para o estudo de NF1, seis puderam ser estudados para o diagnóstico diferencial de RASopatias por sequenciação completa do exoma (WES) aplicando um painel virtual de RASopatias. Foram encontradas anomalias moleculares em quatro destes seis doentes: em dois doentes, foram detetadas duas novas variantes provavelmente patogénicas, c.1769A>G no SOS1, e c.410C>A no LZTR1, genes associados à síndrome de Noonan; nos outros dois doentes, foram identificadas duas grandes deleções: no MAP2K2 e no HRAS.Conclusão: Esta estratégia de duas etapas revelou ser altamente eficiente, uma vez que a combinação de três métodos diferentes e complementares (sequenciação de gDNA e de cDNA e MLPA) permitiram identificar 19 variantes diferentes, quatro das quais não tinham sido previamente descritas. A inclusão da sequenciação do cDNA no algoritmo de diagnóstico foi fundamental para compreender o impacto das variantes do DNA no mRNA do NF1. Para uma melhor e correta avaliação da sensibilidade deste estudo, devem ser excluídos os diagnósticos diferenciais de NF1 em todos os doentes negativos e mais indivíduos devem ser estudados.