Influence of light wavelength on cellular viability after photodynamic therapy

Abstract

A terapia fotodinâmica (PDT) combina três elementos: um composto, denominado de fotossensibilizador (PS), que é ativado pela luz, luz e oxigénio molecular. O PS absorve luz, o que induz um estado de energia excitado, em que parte da energia absorvida em excesso é transferida para o oxigénio molecular, produzindo espécies reativas de oxigénio (ROS), particularmente oxigénio singleto, que pode induzir morte celular. Este processo não pode ser considerado independentemente da complexidade do organismo, o que significa que os resultados biológicos causados pela PDT devem ser percebidos, tanto quanto possível, tendo em consideração todas as interações possíveis entre a luz e o PS com compostos endógenos, e as possíveis mudanças induzidas em processos bioquímicos e biológicos normais. O objetivo deste trabalho foi aplicar um protocolo de PDT, ativando um PS com diferentes comprimentos de onda, avaliando a influência da luz na viabilidade celular e as diferenças na utilização de um PS solúvel em água e um hidrofóbico. De forma a avaliar os resultados da PDT é necessário que o número de fotões absorvidos seja o mesmo para todos os comprimentos de onda utilizados, de acordo com a regra de Kasha. Neste estudo, foram selecionados três LEDs (light emitting diodes), que emitem a 415 nm, 505 nm e a 630 nm. Estes LEDs têm a capacidade de ativar, respetivamente, cada pico de absorção das porfirinas. Assim, foram selecionadas duas porfirinas utilizadas anteriormente em PDT, uma denominada LUZ51P, uma molécula hidrofóbica (LogP ca. 3), com capacidade de se acumular em organelos celulares tais como reticulo endoplasmático, complexo de Golgi e/ou mitocôndria, e outra denominada LUZ10P, que é solúvel em água (LogP -1.4) e com localização maioritária na via endocítica. Esta escolha permitiu o estudo de duas moléculas que absorvem nos comprimentos de onda selecionados e que têm diferentes co-localizações nos organelos celulares. Os resultados demonstraram que a viabilidade celular usando a LUZ51P ativada a 415 nm é muito menor do que quando ativada a 630 nm, e que os resultados ativados a 505 nm foram próximos aos obtidos com 415 nm. Usando a molécula LUZ10P, as diferenças para os vários comprimentos de onda foram menos evidentes. Assim, estes resultados sugerem que as diferentes co-localizações dos dois PSs usados têm influência nos resultados de viabilidade celular, mas também influência no processo sinergístico verificado para a luz azul, que aumenta o efeito da PDT em comparação com a luz vermelha. Este processo sinergístico é mais evidente para a LUZ51P em comparação com a LUZ10P. O tipo de morte celular induzida pela PDT foi avaliado utilizando sondas fluorescentes, sugerindo que a ativação da LUZ51P com luz azul induz morte celular por apoptose, que sugere ser o fator diferencial na viabilidade celular quando comparado com o 630 nm. O processo de indução de apoptose está associado com a libertação do citocromo c, uma proteína que tem na sua estrutura uma porfirina, sugerindo uma possível interação sinergística a 415 nm e 505 nm e menos a 630 nm. Esta hipótese foi testada administrando um inibidor, BAI-1, da cadeia bioquímica relacionada com a libertação do citocromo c, em que os resultados preliminares irradiando a 505 nm e a 630 nm, sugerem um aumento na viabilidade celular comparativamente com os resultados usando apenas o PS para ambos. Os resultados obtidos com o LED 630 nm sugerem que o mecanismo biológico envolvido é mais complexo do que o inicialmente proposto.Este trabalho permite concluir que a ativação de fotossensibilizadores, nomeadamente porfirinas, com diferentes comprimentos de onda (415, 505 e 630 nm), usando o mesmo número de fotões absorvidos, induz diferentes fototoxicidades. Este efeito também depende da localização sub-celular, sendo mais proeminente para a porfirina com tropismo ER-GA. No geral, estes resultados sugerem que ocorre um processo sinergístico entre o efeito da PDT e a luz a 415 e 505 nm. A ocorrência deste processo sinergístico foi um claro resultado, uma vez que somente com a PDT, e com a condição de ter o mesmo número de fotões absorvidos, a viabilidade celular deveria ser a mesma, independentemente do comprimento de onda.

Photodynamic therapy (PDT) combines three elements: a compound, named as photosensitizer (PS), that is activated by light, light and molecular oxygen. The PS absorbs light leading it to an excited state of energy. Subsequently, part of the excess of the absorbed energy is transferred to molecular oxygen, producing reactive oxygen species (ROS), particularly singlet oxygen, which may induce cell death. This process cannot be considered separately from the organism complexity, meaning that PDT biological outcomes should be understood, as much as possible, accounting all extents of interaction of light and PS with endogenous compounds and the possible changes induced in the normal biochemical and physiological processes. The aim of this work was to perform a PDT protocol activating the PS with light of different wavelengths, evaluating the influence of wavelengths on the cell viability and how a water-soluble and a hydrophobic PS may induce different PDT results. In order to assess the PDT outcomes using different wavelengths, the number of photons absorbed must be the same for all wavelengths, accordingly to the Kasha’s rule. In this sense, we selected three light emitting diodes (LED) emitting at 415 nm, 505 nm and 630 nm. These LEDs have the ability to activate the respective absorption peaks of porphyrins molecules. Thus, two porphyrins previously used in PDT (Photodynamic Therapy) were selected: one hydrophobic molecule (Log P approximately 3) called LUZ51P, with the ability to accumulate in cellular organelles such as endoplasmic reticulum (ER), Golgi apparatus (GA), and/or mitochondria, and another water-soluble (Log P -1.4) called LUZ10P, with predominant localization in the endocytic pathway. The selection of these two porphyrins allows the study of two molecules with different subcellular localizations and that absorb at selected wavelengths. The results showed that the cellular viability using LUZ51P activated at 415 nm is much lower than when its activation was performed at 630 nm; at 505 nm the results were close to that at 415 nm. Using the LUZ10P molecule, the differences between the wavelengths were less evident. Thus, these results suggested that different co-localizations of the two PSs used have an influence on the cell viability, and also have an influence on the synergistic process verified for the blue light. Indeed, the synergistic process observed at 415 nm is more evident for LUZ51P compared to LUZ10P, which exhibits less accumulation in the mitochondria.The type of cell death induced by PDT was assessed using fluorescent probes, suggesting that activation of LUZ51P with blue light induces cell death by apoptosis. Apoptosis is associated with cytochrome c release, a protein that has a porphyrin in its structure, suggesting a possible synergistic interaction. This hypothesis was tested giving an inhibitor, BAI-1, of the biochemical chain related to the release of cytochrome c. The preliminary results obtained when irradiating at 505 nm and 630 nm suggest an increase in cell viability compared to the PS alone. The increased cell viability obtained with LUZ51P and BAI-1 at 630 nm were unexpected, which may indicate that the biological mechanism involved is more complex than initially proposed.This work permit to conclude that activation of photosensitizers, namely porphyrins, with different wavelengths (415, 505 and 630 nm), using the same number of absorbed photons, induces different phototoxicities. This effect is also dependent on the subcellular localization as it was more prominent for the porphyrin with ER-GA tropism. Overall, these results suggest that a synergistic process occurs between the PDT effect and the light at 415 and 505 nm. This is clear because with PDT alone and under the condition of having the same number of absorbed photons, the cell viability should be the same regardless the light wavelength.