Dissecting the Mechanisms Underlying the Anti-Inflammatory Effects of Sitagliptin on Microglial Cells

Abstract

Diabetic retinopathy is a chronic neurovascular disease associated to diabetes, emerging as a primary driver of vision impairment and blindness among working-age adults. The origins of this condition lie predominantly in elevated blood glucose levels and enduring retinal inflammation, playing retinal microglial cells a significant role in inflammation.In acute injury, microglia are prompted into action, engaging in a dual role of both anti-inflammatory and pro-inflammatory functions. Under chronic hyperglycemia, persistent inflammation occurs in the retina leading to a continuous microglial reactivity, perpetuating the injury. Consequently, pro-inflammatory cytokines, such as tumor necrosis factor (TNF) and interleukin-1β (IL-1β), chemokines, and other mediators like inducible nitric oxide synthase (iNOS) contribute to the pathogenesis of diabetic retinopathy. Among individuals with diabetes, these pro-inflammatory cytokines and chemokines are heightened, resulting in cellular failure in the retina and the disruption of the blood-retinal barrier (BRB).Dipeptidyl peptidase 4 (DPP4) is a serine exopeptidase, with an important role in the cleavage of incretin hormones, growth factors, cytokines, and chemokines, thus participating in diverse physiological processes, including immune responses and the regulation of inflammation.Sitagliptin is a DPP4 inhibitor that inhibits the cleavage of incretin hormones, leading to an increase in their levels, and consequently insulin secretion and a decrease in glucose production. Beside this, we previously reported that sitagliptin has protective and anti-inflammatory effects in the diabetic retina, inhibiting the increase of pro-inflammatory cytokine levels, nitrosative stress, and apoptosis, as well as the breakdown of the BRB. Furthermore, it inhibits the lipopolysaccharide (LPS)-induced augmentation of iNOS immunoreactivity in CD11b-positive cells in retinal primary cell cultures and organotypic cell cultures, as well as microglial morphological changes triggered by LPS. However, our previous data did not demonstrate whether sitagliptin is able to directly inhibit microglia reactivity.Therefore, this study was undertaken with the aim of 1) determining whether sitagliptin can directly exert anti-inflammatory effects on microglial cells; and 2) establishing whether these effects were contingent upon the inhibition of DPP4 by sitagliptin, or if other pleiotropic effects might be at play.To accomplish our aims, we used two in vitro models: BV-2 cells, a microglia cell line, and Dpp4 knock-out (KO) BV-2 cells. Our experimentation involving the exposure of BV-2 cells to LPS, in the absence or presence of sitagliptin, yielded significant findings.Sitagliptin effectively inhibited the LPS-induced upregulation of iNOS, IL-1β, and TNF protein levels, and it reduced the heightened phagocytic efficiency observed in these cells when exposed to LPS. These results provide strong evidence supporting the anti-inflammatory properties of sitagliptin and its direct impact on microglial cells. On the other hand, while we were successful in generating Dpp4 KO cells and ascertained that the deletion of Dpp4 did not alter the morphology of these cells, our investigations revealed that sitagliptin did not exert its preventive effect on the LPS-induced increase in phagocytic efficiency in the Dpp4 KO cells, indicating that the effect of sitagliptin was essentially due to DPP4 inhibition.In conclusion, this study unequivocally establishes that sitagliptin exerts a direct influence on microglial cells, and particularly anti-inflammatory effects. Despite the results obtained suggesting that the effect of sitagliptin is mediated by the inhibition of DPP4, further investigation is needed to determine whether the sitagliptin anti-inflammatory properties are exclusively dependent on its interaction with DPP4, or if there are other pleiotropic effects, that might also play a role.

A retinopatia diabética é uma doença neurovascular crónica associada à diabetes, sendo uma das principais causas de perda de visão e cegueira em adultos em idade ativa. As causas desta patologia residem predominantemente nos níveis elevados de glicose no sangue e na inflamação crónica da retina, tendo as células da microglia da retina um papelimportante na inflamação.Em situações agudas, as células da microglia desempenham um papel duplo que inclui funções anti e pró-inflamatórias. Em condições de hiperglicemia crónica, ocorre inflamação persistente na retina, causando reatividade microglial permanente, perpetuando assim a lesão. Como resultado, citocinas pró-inflamatórias como o fator de necrose tumoral (TNF) e a interleucina-1β (IL-1β), quimiocinas e outros mediadores como a síntaseinduzível do monóxido de azoto (iNOS) contribuem para a patogénese da retinopatia diabética. Em indivíduos com diabetes, os níveis destas citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas estão elevados, resultando em alterações e danos celulares na retina e na barreira hematorretiniana.A dipeptidil peptidase 4 (DPP4) é uma exopeptidase de serina, com um papelimportante na clivagem das hormonas incretinas, fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas, participando assim em diversos processos fisiológicos, incluindo respostasb imunes e regulação da inflamação.A sitagliptina é um inibidor da DPP4 que inibe a clivagem de hormonas incretinas, conduzindo a um aumento dos níveis das mesmas, e consequentemente, da secreção de insulina e a uma diminuição da produção de glicose. Além disso, reportámos previamente que a sitagliptina tem efeitos protetores e anti-inflamatórios na retina diabética, inibindo o aumento dos níveis de citocinas pró-inflamatórias, o stress nitrosativo e a apoptose, bem como a rutura da barreira hematorretiniana. Além disso, a sitagliptina inibe o aumento da imunorreatividade da iNOS em células CD11b-positivas, em culturas primárias de células da retina e culturas organotípicas de retina, bem como as alterações morfológicas das células da microglia induzidas por exposição a lipopolissacarídeo (LPS) [26–28]. No entanto, os nossos resultados anteriores não demonstraram se a sitagliptina é capaz de inibir diretamente a reatividade da microglia.Deste modo, este estudo foi realizado com o objetivo de 1) determinar se asitagliptina pode exercer efeitos anti-inflamatórios diretamente nas células da microglia; e 2) verificar se esses efeitos dependem da inibição da DPP4 pela sitagliptina, ou se existem outros efeitos pleiotrópicos.Para atingir os objetivos, utilizaram-se dois modelos in vitro: células BV-2, uma linha celular de microglia, e células BV-2 Dpp4 knock-out (KO). As experiências envolvendo a exposição de células BV-2 a LPS, na ausência ou presença de sitagliptina, produziram resultados significativos. A sitagliptina inibiu eficazmente o aumento dos níveis das proteínas iNOS, IL-1β e TNF, induzido pelo LPS, e inibiu o aumento da eficiência fagocítica detetada nestas células, quando expostas a LPS. Estes resultados fornecem evidências claras que suportam as propriedades anti-inflamatórias da sitagliptina e também o seu impacto direto nas células da microglia. A obtenção de células DPP4 KO foi bem sucedida, e verificou-se que a deleção de Dpp4 não alterou a morfologia das células. Os resultados com as células BV-2 Dpp4 KO revelaram que a sitagliptina não exerceu o seu efeito preventivo sobre o aumento da eficiência fagocítica induzido pelo LPS nestas células, indicando que o efeito da sitagliptina se deve, essencialmente, à inibição da DPP4.Em conclusão, este estudo estabelece inequivocamente que a sitagliptina exerce uma influência direta nas células da microglia, e particularmente, efeitos anti-inflamatórios. No entanto, apesar dos resultados obtidos sugerirem que o efeito da sitagliptina é mediado pela inibição da DPP4, é necessário prosseguir com a investigação, de modo a determinar se as propriedades anti-inflamatórias da sitagliptina dependem exclusivamente da sua interação com a DPP4, ou se existem outros efeitos pleiotrópicos, que também poderão desempenhar um papel nos efeitos da sitagliptina.