Production of the recombinant retropepsin-like Protease from Rickettsia Conorii (APRc)

Abstract

There is growing concern about rickettsioses and their impact on global health, being identified as emerging pathogens. The aspartic protease of Rickettsia conorii (APRc) has emerged as a candidate target for intervention against rickettsioses, which can be produced using genetically modified microorganisms. In this project, APRc will be produced using E. coli. The project challenge aimed to enhance the yields of dimer vs. monomer, due to the limitation for obtaining the canonical dimer of APRc and pursuing studies on the structure-function relationship of APRc, not allowing the design of specific inhibitors. To overcome these limitations, this project studied alternative cell lysis methods and changes to the method currently used in the APRc production process from E. coli. Mechanical cell lysis tests were carried out using a high-pressure homogenizer (HPH) and physicochemical tests (application of surfactants, temperature, freezing-thawing cycles) to optimize the protease production yields.Initially, mechanical lysis was evaluated and, depending on the test carried out, the conditions to which the cell pellet was subjected were modified. First, the standard method was replicated for comparison with the modifications introduced in the following tests, to optimize the cell lysis method with EmulsiflexR-C3 connected to a pressure of 4 bar of nitrogen, with a pressure on the sample of 1700 bar, and using a minimum volume of 30 mL and passing the pellet through at least 3 compression cycles. Next, the standard APRc production process was optimized, varying the number of cycles and the pressure applied to the sample. Concerning the recovery yields of dimer, the standard method yielded 0.45 of dimer, while a change to this method applying minimal pressure to the sample and increasing the number of cycles yielded 1.74 mg of the dimeric form of the protease. The physicochemical cell disruption methods evaluated different freezing/thawing cycles (1 or 4) and thawing temperatures (20 °C and 37 °C), with the addition of different buffer solutions with pH 7.4, and the addition of surfactants (SDS - Sodium Dodecyl Sulfate). In these tests, the yield of dimer was 0.54, showing an improvement of 17% than the standard method. The results also showed that the addition of surfactants difficult the processing of cell pellets, i.e., difficult the re-solubilization. The temperature increase led to an almost complete loss of the target-protein. The development of this project demonstrated that the most effective method for cell lysis of E. coli cells is mechanical lysis using HPH by applying minimal pressure to the sample - a change to the standard method previously applied to obtain APRc. The changes made to the standard procedure made it possible to optimize the rupture process and increase the yield of the dimeric form of APRc from 0.45 to 1.74 (74%).

Há uma preocupação crescente com as rickettsioses e o seu impacto na saúde global, sendo apontadas como agentes patogénicos emergentes/reemergentes. A protease aspártica da Rickettsia conorii (APRc) surgiu como um candidato alvo para a intervenção contra as rickettsioses, a qual pode ser produzida por microrganismos geneticamente modificados. Neste projeto, a APRc foi produzida utilizando a E. coli. O desafio deste projeto objetivou melhorar os rendimentos de dímero vs. monómero, devido às dificuldades para obter o dímero canónico da APRc e prosseguir estudos sobre a relação estrutura-função da APRc, impedindo o desenho de inibidores específicos. Para ultrapassar estas limitações, este projeto estudou métodos de lise celular alternativos e modificações ao processo atualmente utilizado no processo de produção da APRc a partir de E. coli. Foram realizados ensaios de lise celular mecânicos, utilizando um homogeneizador de alta pressão (HPH, high-pressure homegenizer) e físico-químicos (aplicação de surfactantes, temperatura, ciclos de congelação-descongelação) para otimizar os rendimentos de produção da protease. Inicialmente, avaliou-se a lise mecânica e, dependendo do ensaio realizado, as condições a que o pellet celular foi submetido foram modificadas. Primeiro replicou-se o método padrão para comparação com as modificações introduzidas nos ensaios seguintes, a fim de otimizar o método de lise celular utilizando o EmulsiflexR-C3 ligado a uma pressão de 4 bar de azoto, com uma pressão sobre a amostra de 1700 bar, utilizando um volume mínimo de 30 mL e a passagem do pellet no mínimo de 3 ciclos de compressão. Em seguida, procedeu-se à otimização do processo padrão, variando o número de ciclos e a pressão aplicada na amostra. Em relação ao rendimento, o método padrão apresentou um rendimento de 0,45 de dímero, enquanto uma alteração a este método com a aplicação de uma pressão mínima na amostra e um aumento do número de ciclos, permitiu obter 1,74 da forma dimérica da protease.Os métodos de rompimento celular físico-químicos avaliaram o efeito de diferentes ciclos (1 ou 4) de congelação/descongelação e temperaturas de descongelação (20 °C e 37 °C), com a adição de diferentes soluções tampão com pH 7.4, e adição de surfactantes (SDS – Dodecil sulfato de sódio). Nestes ensaios, o rendimento de dímero obtido foi de 0,54, apresentando uma ligeira melhoria de 17% relativamente ao método padrão. Os resultados mostraram ainda que a adição de surfactantes dificulta o processamento dos pellets celulares, isto é, de difícil ressolubilização. O aumento da temperatura levou a uma perda quase completa da proteína de interesse.O desenvolvimento deste projeto demonstrou que o método mais eficaz de lise celular das células de E. coli é a lise mecânica utilizando o HPH aplicando uma pressão mínima na amostra - uma alteração ao método padrão previamente aplicado na obtenção da APRc. As alterações feitas ao procedimento padrão permitiram otimizar o processo de rompimento e aumentar o rendimento da forma dimérica de APRc de 0,45 para 1,74 (74%).