Dissecting the role of adenosine A2A receptors on neurobehavioral deficits induced by binge-like exposure to ethanol during adolescence

Abstract

A adolescência é um período associado a um aumento da tomada de riscos e da procura de sensações, que estão na base de comportamentos impulsivos, como o consumo de álcool. Entre os adolescentes, isto implica tipicamente um padrão de consumo excessivo de álcool. Uma vez que se trata de um período muito crítico do desenvolvimento neurológico, o cérebro jovem torna-se um alvo vulnerável aos efeitos do álcool, com potencial para desencadear alterações comportamentais duradouras e disfunções cognitivas.O sistema adenosinérgico é um importante modulador da transmissão sináptica e da inflamação no sistema nervoso central, que ajuda a manter o equilíbrio entre a neurotransmissão excitatória e inibitória, regula as respostas imunitárias e protege contra a inflamação excessiva, contribuindo para muitos dos diversos efeitos do etanol no cérebro. Estudos sugerem que os receptores A1 da adenosina (A1R) e os receptores A2A de adenosina (A2AR) regulam muitas das respostas neuronais agudas e crónicas ao álcool e estão envolvidos na flexibilidade comportamental, na ansiedade, na interação social e na cognição, relevantes para o AUD. O tónus de adenosina em resposta ao álcool pode variar, dependendo da duração da exposição ao etanol e dos receptores que modulam os efeitos em diferentes regiões do cérebro.Tendo em conta o aumento do consumo excessivo de álcool entre adolescentes do sexo feminino, que são mais vulneráveis aos efeitos neurotóxicos e cognitivos do álcool em excesso, foi estabelecido um modelo de exposição crónica intermitente ao etanol em ratos adolescentes do sexo feminino, tanto pelos nossos colaboradores como no nosso laboratório. Dados não publicados mostram défice de LTP no córtex pré-frontal medial pré-límbico (PLmPFC), bem como défices de memória de reconhecimento a curto prazo e ansiedade, que são revertidos pelo bloqueio crónico dos A2AR. Neste estudo tivemos como objetivo avaliar as possíveis alterações sinápticas e gliais associadas a esses efeitos benéficos dos A2AR no mPFC do mesmo modelo animal.Para o efeito, ratos Wistar adolescentes do sexo feminino (PND 35-58) foram submetidos a 4 ciclos de consumo excessivo de álcool entre a adolescência e o final da adolescência/início da idade adulta. Cada ciclo consistiu em 3 dias consecutivos de administração de etanol (EtOH; 3g/kg/dia, 20% p/v de etanol) ou água destilada por gavagem gástrica (Fernandes et al. Behav Brain Res. 2018; 350: 99-108). Concomitantemente, os ratos foram injetados intraperitonealmente (i.p.) todos os dias a partir do PND 38-58 com uma solução salina ou um antagonista dos A2AR (SCH58261; 0,1 mg/kg/dia) 2h após o episódio de consumo excessivo de álcool. Após 24 horas de abstinência do tratamento com etanol, os ratos foram testados no teste do campo aberto e no teste de reconhecimento de objeto novo, após os quais os cérebros foram coletados para dissecar o mPFC para neuroquímica ou para obter secções cerebrais para imunohistoquímica.Os nossos resultados indicam que a exposição ao etanol em ratos Wistar fêmeas adolescentes não provoca alterações comportamentais significativas, ao contrário do observado pelos nossos colaboradores. Do ponto de vista neuroquímico, observámos uma diminuição da densidade de vGlut1, vGAT e SNAP25 no PLmPFC, o que sugere uma diminuição da libertação de GABA e glutamato, possivelmente explicando os défices de LTP no PLmPFC presentes no modelo. A recuperação da LTP observada após tratamento crónico com o antagonista seletivo dos A2AR está provavelmente relacionada com o aumento do acoplamento de vesículas sinápticas e da libertação de neurotransmissores, devido à prevenção da diminuição da densidade de SNAP-25 induzida pelo etanol. Relativamente às células da glia, não observámos alterações na morfologia dos astrócitos e no número de microglia ativa. No entanto, no que diz respeito à reconstrução 3D da microglia, observou-se um maior número de intersecções de Sholl mais próximas do centro do soma e um aumento do comprimento total dos processos no PLmPFC dos ratos tratados com etanol, o que é consistente com um perfil morfológico de hiper-ramificação, geralmente descrito como um passo transitório intermédio a uma fase de ativação total. A hiper-ramificação não está associada a marcadores de neuroinflamação ou neurotoxicidade, mas pode levar ao comprometimento de respostas fisiológicas típicas da microglia, como a poda sináptica. Deve ser efectuada uma análise mais aprofundada da microglia 3D de animais tratados com etanol e SCH58261 para avaliar se os A2AR têm algum papel nessa alteração morfológica.De um modo geral, com o trabalho desenvolvido nesta tese, descobrimos que o bloqueio o do A2AR provavelmente previne os défices de LTP do PLmPFC ao impedir a diminuição da libertação de neurotransmissores induzida pelo etanol.Além disso, a exposição crónica ao etanol parece levar a alterações morfológicas da microglia, que também podem estar envolvidas nos défices de LTP do PLmPFC encontrados.

Adolescence is a period associated with increased risk-taking and sensation-seeking, which underlie impulsive behaviours, such as alcohol intake. Among adolescents this typically entails a pattern of binge drinking.Since this is a very critical period of neurodevelopment, the young brain becomes a vulnerable target to alcohol’s effects, with the potential to trigger long-lasting behavioral changes and cognitive dysfunction.The adenosinergic system is a master modulator of synaptic transmission and inflammation in the central nervous system (CNS), that helps maintain balance between excitatory and inhibitory neurotransmission, regulate immune responses and protect against excessive inflammation, contributing to many of the diverse effects of ethanol on the brain. Evidence suggests that the adenosine A1 receptors (A1R) and adenosine A2A receptors (A2AR) regulate many of the acute and chronic neuronal responses to alcohol and are involved in behavioral flexibility, anxiety, social interaction and cognition, relevant to AUD. Adenosine tone in response to alcohol can vary, depending on the duration of ethanol exposure and on the receptors modulating the effects within different brain regions.In light of the increased binge drinking among female adolescents, who are more vulnerable to the neurotoxic and cognitive effects of heavy alcohol, a model of chronic intermittent exposure to ethanol in female adolescent rats was established, both by our collaborators and in our lab. Unpublished data show impairment of long-term potentiation (LTP) in the prelimbic medial prefrontal cortex (PLmPFC), as well as in short-term recognition memory deficits and anxiety, that is reversed by the chronic blockade A2AR. For this study we aimed to evaluate possible synaptic and glial mechanisms associated with those beneficial effects of A2AR in the mPFC of the same animal model.For that, female adolescent Wistar rats (PND 35-58) underwent 4 cycles of binge drinking mid adolescence to late adolescence/early adulthood. Each cycle consisted of 3 consecutive days of administration of ethanol (EtOH; 3g/kg/day, 20% w/v ethanol) or distilled water via gastric gavage (Fernandes et al. Behav Brain Res. 2018; 350: 99–108). Concomitantly, rats were intraperitoneally (i.p.) injected every day from PND 38-58 with a saline or A2AR antagonist (SCH58261; 0.1 mg/kg/day) solution 2h after the binge episode. Following 24h withdrawal from ethanol treatment, rats were tested on the open field test and the novel object recognition test, after which their brains were collected to dissect mPFC for neurochemistry or to obtain brain sections for immunohistochemistry.Our results indicate that binge-like exposure to ethanol in adolescent female Wistar rats does not lead to any significant behaviour alterations, unlike our collaborators observed. Neurochemically, we observed a decreased density in vGlut1, vGAT and SNAP25 in the PLmPFC, suggesting decreased release of GABA and glutamate, possibly explaining the deficits in PLmPFC LTP that is present in the model. The LTP recovery observed upon chronic treatment with the selective A2AR antagonist is likely related to increased synaptic vesicle docking and neurotransmitter release, due to the prevention of ethanol-induced decrease in SNAP-25 density.Regarding glial cells, we did not observe alterations in astrocytes morphology and number of active microglia. However, regarding microglia 3D reconstruction, there was a greater number of intersections closer to the center of the soma and increased total length of processes in the PLmPFC of ethanol-treated rats, which is consistent with a hyper-ramification morphological profile, generally described as a transitional step intermediate to a full activation phase. Hyper-ramification has not been associated with markers of neuroinflammation or neurotoxicity but can lead to the impairment of typical microglial physiological responses, such as synaptic pruning. Further analysis of 3D microglia from animals treated with ethanol and SCH58261 will clarify whether A2AR play a role in such morphological change. Overall, with the work in this thesis, we uncovered that blockade of A2AR likely prevents PLmPFC LTP deficits by preventing ethanol-induced decrease in neurotransmitter release. Additionally, chronic ethanol exposure seems to lead to microglial morphological alterations, which could also be involved in the PLmPFC LTP deficits encountered, although the effects of the blockade of A2AR on this analysis remain to be elucidated.