Contribution of Sperm Ageing in Epigenetics Signature of Anopheles susceptibility to Plasmodium Malaria Parasite

Abstract

A malária é uma patologia transmitida por vetores, onde o Plasmodium (parasitacausador da malária) é transmitido ao humano pela picada de fêmeas Anopheles erepresenta um enorme fardo em mais de 90 países endémicos. Além do diagnóstico tardio,um dos maiores problemas no combate à malária é a disseminação de resistência aotratamento pelo parasita e disseminação da resistência aos inseticidas pelo vetor, omosquito.Ruiz et al mostrou que infeção por Plasmodium induz modificações nashistonas em mosquitos Anopheles. O laboratório de acolhimento mostrou a existência deum efeito materno na sobrevivência da descendência, o que poderá influenciar aepidemiologia da malária. Uma vez que as fêmeas Anopheles só acasalam uma única vezem todo o seu tempo de vida, poderá haver uma influência paterna por detrás do efeitomaterno já detetado. Os efeitos parentais estão associados a mecanismos epigenéticoscomo a metilação do DNA, onde 6mA (N6-metiladenina) é exemplo disso eintrinsecamente associada a DMAD (enzima responsável pela sua de-metilação).O principal objetivo deste projeto é decifrar a base molecular do efeito maternopaternal em Anopheles, mais especificamente a influência do envelhecimento espérmicona sobrevivência e suscetibilidade ao Plasmodium falciparum na descendência deAnopheles gambiae.Uma análise fenotípica foi realizada de modo a desvendar a existência de efeitopaterno. Para atingir o objetivo foram desenhados três cruzamentos: DP1my (fêmea velhax esperma jovem), DP1o (fêmea velha x esperma velho) e DP1y (fêmea jovem x espermajovem). Neles foi realizado um ensaio de sobrevivência até o último mosquito morrer, eparalelamente foram analisados os padrões de expressão de METTL3 (gene envolvido nametilação 6mA de RNA) e de DMAD (a demetilase) em embriões com 24h dedesenvolvimento, e fêmeas e machos Anopheles de cada cruzamento planeado.Confirmámos o efeito materno na sobrevivência da descendência de Anophelesfêmeas, onde fêmeas mais velhas conferem melhores probabilidades, porém não foi claraa ligação com efeito paterno. No entanto, na análise das marcas epigenéticas a existênciade efeitos parentais (materno e paterno) foi detetada, onde fêmeas mais velhas produzemdescendência com níveis mais baixo de DMAD e METTL3, enquanto esperma maisVIvelho mostra um efeito contrário no padrão de de-metilação. Foi também realizada aanálise de conteúdo proteico das amostras revelando que a análise de fases embrionáriasdo desenvolvimento de Anopheles são cruciais para mais detalhes sobre efeitos parentais.

Malaria is a vector-borne disease where Plasmodium parasite is transmitted by thebite of female Anopheles and represents a huge burden in more than 90 endemic countries.Beside the late diagnosis, one of the biggest problems on tackling malaria is thedissemination of resistance to treatment by Plasmodium parasite and even disseminationof insecticide resistance by the vector, the mosquito. Whereas Ruiz et al showed that theinfection by Plasmodium in Anopheles induces histone mark modifications, the hostinglab showed that there is a maternal influence on the survivorship of the offspring, thatmay influence the epidemiology of malaria. Since female Anopheles mosquitoes onlymate once in their lifetime it may exist a paternal effect behind it as well. Parental effectsare associated with epigenetic mechanisms as methylation of DNA, as example, 6mAmark intrinsically associated with DMAD (responsible for its demethylation).The main goal of this project was to decipher the molecular basis of maternalpaternal effect in Anopheles, more specifically the influence of sperm ageing onsurvivorship and susceptibility to Plasmodium falciparum of Anopheles gambiaeprogeny.A phenotypical analysis was performed in order to unravel the existence ofpaternal effect. To reach the purpose three crosses were designed: DP1my (old female xyoung sperm), DP1o (old female x old sperm) and DP1y (young female x young sperm).Therefore, was performed a survival assay until the last mosquito die and the expressionpatterns of METTL3 (a gene initially involved in 6mA RNA methylation) and of DMADa 6mA demethylase, were analysed on embryos of 24h development and female and maleAnopheles adults from each cross.We confirmed the maternal influence on the survivorship of female progenies,where older mothers confer better chances, however the paternal effect was not thatobvious. However, on the epigenetics marks the existence of both parental effects wasevidenced, where older females produce offspring with diminished level of DMAD andMETTL3, while the older sperm show an opposite effect on the demethylation pattern.The protein content was analysed as well, revealing that the embryogenic stages arerelevant for further detailed studies on parental effects.