Establishment of a 3D multi-layered intestinal inflammation model

Abstract

A Doença de Crohn e a Colite Ulcerosa são os principais tipos da Doença Inflamatória Intestinal (DII). Estas doenças inflamatórias intestinais são altamente debilitantes e uma cura definitiva não está disponível nas clínicas. O estabelecimento de modelos in vitro confiáveis e úteis da barreira intestinal inflamada para agilizar e validar o desenvolvimento de terapias para a DII é, portanto, de extrema relevância. O nosso grupo de investigação estabeleceu anteriormente um modelo de cultura de células tridimensional (3D) de intestino saudável, que compreende uma barreira endotelial, composta por células HPMEC-ST1.6R, uma camada à base de colagénio que incorpora fibroblastos intestinais humanos (HIFs) e, por último a camada epitelial, composta por células Caco-2 e células HT29-MTX produtoras de muco. Vendo as falhas existentes na representação in vitro do ambiente inflamatório, propomos melhorar este modelo 3D através da adição de células THP-1 (mimetizando o fenótipo dos macrófagos) na lâmina própria para mimetizar as principais características da inflamação e aumentar a complexidade do modelo e interação célula a célula.O estabelecimento de uma camada 3D de colagénio com células HIF e dTHP-1 para mimetizar a lâmina própria exigiu primeiro a diferenciação de células THP-1 em macrófagos. A camada de colagénio 3D com células HIF e dTHP-1 foi alcançada com uma concentração de colagénio de 6 mg/mL, uma densidade inicial de HIF de 5 x 104 células/mL e uma densidade inicial de THP-1/dTHP-1 de 2,5 x 105 células/mL. Para caracterizar esta camada, a atividade metabólica ao longo do tempo foi avaliada. Para além disso, coloração por hematoxilina e eosina, análise por imunohistoquímica das diferentes populações celulares e ensaios de viabilidade celular foram também realizados. Os resultados da atividade metabólica mostraram que os fibroblastos e macrófagos estavam ativos dentro dos géis, indicando que estavam saudáveis e a proliferar. Após o estabelecimento bem-sucedido da camada 3D de colagénio com HIF e dTHP-1, a inflamação foi induzida com LPS. Os resultados mostram que os valores de TEER foram mantidos após a indução da inflamação. No modelo 3D tratado com LPS, a secreção de citocinas pró-inflamatórias (IL-6) foi significativamente aumentada, em comparação com o modelo 3D sem LPS. Como houve aumento da citocina pró-inflamatória IL-6 no modelo 3D com LPS, a inflamação foi induzida.Em conclusão, acreditamos que este modelo 3D de inflamação intestinal tem potencial para ajudar a preencher a lacuna entre testes in vitro e in vivo, o que pode ter um grande impacto no ramo do desenvolvimento de medicamentos e, com isso, contribuir para a política de substituição, redução e refinamento (3Rs), principalmente pela redução do número de experiências com animais.

Crohn's disease and ulcerative colitis are the major types of inflammatory bowel disease (IBD). These intestinal inflammatory diseases are highly debilitating, and a definitive cure is not available in clinics. The establishment of reliable and useful in vitro models of the inflamed intestinal barrier to faster and validate the development of therapies for IBD is, thus, of upmost relevance. Our research group has previously established a three-dimensional (3D) cell culture model of a healthy intestine, that comprises an endothelial barrier, composed of HPMEC-ST1.6R cells, a collagen-based layer embedding human intestinal fibroblasts (HIFs), and lastly, the epithelial layer, composed of Caco-2 cells and mucus-producing HT29-MTX cells. Seeing the existing flaws in the in vitro representation of the inflammatory environment, we propose to improve this 3D model through the addition of THP-1 cells (mimicking the macrophage phenotype) in the lamina propria to better recapitulate the key characteristics of inflammation and increase the model complexity and cell-to-cell interaction.The establishment of a 3D collagen layer with human intestinal fibroblasts (HIF) and differentiated THP-1 (macrophages) cells to mimic the lamina propria first required the differentiation of THP-1 cells into macrophages. The 3D collagen layer with HIF and dTHP-1 cells was achieved with a collagen concentration of 6 mg/mL, a HIF initial seeding density of 5 x 104 cells/mL, and a THP-1/dTHP-1 initial seeding density of 2.5 x 105 cells/mL. To characterize this layer, the metabolic activity was evaluated over time. Hematoxylin and eosin staining, immunohistochemistry analysis for the different cell populations, and cell viability assays were also performed. The metabolic activity results showed that the fibroblasts and macrophages are active inside the gels, indicating that they are healthy and proliferating. Upon successful establishment of the 3D collagen layer with HIF and dTHP-1, inflammation was induced with LPS in the previous 3D intestinal model, and in the already pre-established 3D intestinal model with macrophages. The results show that the TEER values were maintained upon induction of inflammation. In the 3D model treated with LPS, the secretion of pro-inflammatory cytokines (IL-6) was significantly upregulated, compared to the 3D model without LPS. As there was an increase in the pro-inflammatory cytokine IL-6 in the 3D model with LPS, inflammation was induced.Overall, this 3D intestinal inflammation model has the potential to help bridging the gap between in vitro and in vivo testing, which could have a major impact in the drug development field and, by this, contribute to the replacement, reduction, and refinement (3Rs) policy, mainly by reducing the number of animal experiments.