EFFECTS OF PENTOSE PATHWAY INHIBITION ON GLUCOSE METABOLISM IN CELL CULTURE MODELS OF CANCER USING STABLE ISOTOPE TRACERS AND NMR

Abstract

Hepatocellular carcinoma (HCC) accounted for around 4% of all cancer cases in 2020. This number was expected to increase in the future, given the continuing poor prognosis, especially for HCC cases secondary to non-alcoholic fatty liver disease. Therefore, there was a need to understand cancer physiology to better develop therapeutic approaches. In this sense, we aimed to assess pentose phosphate pathway (PPP) as a potential target, in part because of its role in the production NADPH, which studies have showed to have a pivotal role in both catabolism, anabolism and redox homeostasis.HepG2 cell line cultured with glucose and glutamine was provided with [U-13C]glucose, [U-2H]glucose and unlabelled glutamine for 48 hours and studied either in the presence of two doses or absence of Polydatin, an inhibitor of glucose-6-phosphate dehydrogenase. Growth curves and protein expression were determined by SRB assay and Western blot, respectively, while the aqueous extracts were analysed by 1H and 13C NMR. Metabolic fluxes ( Glycolytic and Non-Glycolytic Rates), as well as metabolites quantifications and proteins’ expression levels associated with glucose metabolism was determined to provide insights into glucose metabolism. As for the redox state assessments, they were determined by the ratio lactate to alanine, and the expression levels of proteins associated with Redox response and cytoskeleton arrangements. There was a decrease in growth with the increase in polydatin concentration. This reduction was accompanied by metabolic profile more glycolytic in higher concentrations of Polydatin ( p-value < 0.05). Cells treated with higher concentration of polydatin experienced higher 13C lactate (p-value < 0.01), tyrosine (p-value < 0.05), 13C alanine (p-value < 0.05) levels in extracellular media compared to Control and lower concentration of Polydatin. In terms of intracellular media, higher levels of polydatin were associated with higher levels phosphocreatine to creatine ratio (p-value < 0.05) and IDH 2 expression (p-value < 0.01). The ratio of lactate to alanine was significantly higher with the highest concentrations of polydatin (p < 0.01) while the expression of thioredoxin (p-value < 0.0001), α-tubulin (p-value < 0.001) and actin (p-value < 0.01) were significantly lower. By affecting PPP, there was a shift in the cellular redox state, rather than a shift in glucose metabolism, resulting in an increase in ROS activity, which will lead to a decrease in HCC cell growth and proliferation, supporting the strategy of targeting the PPP as a means of treating HCC.

Carcinoma hepatocellular (CHC) representa certa de 4 % de todos os casos de cancro em 2020. Este número é esperado que aumente no futuro, dado o fraco prognostico, particularmente em casos CHC que tem progedido de doença de fígado gordo não alcolico. Desta forma, existe urgente necessidade em compreender melhor a patofisiologia do cancro, de forma a desenvolver melhores abordagens terapeuticas. Tenho isto em mente, neste trabalho que verificar a vias das pentoses phosphato com um potencial alvo terapeutico, em parte devido ao seu papel na produção de NADPH, que estudo demonstraram o seu papel crucial no catbolismo, anabolismo e controlo do estado redox da célula.Linha celular HepG2 foi cultivado com glucose, metade [U-13C]glucose e outra metade [U-2H]glucose, e glutamina não marcada por 48 horas e estudada na ausência ou na presença de duas concentrações de Polidatina, um inibidor da glucose-6-phosphato dehidrogenase. Curvas de crescimento e expressão de proteína foram determinado pelo ensaio de SRB e Western blot, respetivamente, enquanto os meios e extratos aquosos foram 1H RMN e o ultimo foi complementado com uma 13C RMN. Fluxos metabólicos (Taxa de glicose e taxa de glicolise), assim como quantificação de metabolitos e nívewasde expressão de proteínas associadas ao metabolismo da glucose foram determinados de forma a termos um visão mawasampla do metabolismo da glucose. Quanto à determinação do estado redox da célula, este foi avaliado pelo ratio lactato/alanina, bem como pelos nívewasde expressão de proteínas associadas à reposta ao stress oxidativo e arranjo do citoesqueleto.Com o aumento da concentração de Polidatina houve um redução do crescimento celular. Esta redução foi acompanhada por mudança para um perfil metabólico mawasglicolitico ( valor-p < 0.05). As células tratadas com maiores concentrações de Polidatina também apresentaram maiores concentrações de 13C lactato (valor-p < 0.01), tirosina (valor-p < 0.05), 13C alanina (valor-p < 0.05) em meios extracelulweres, comparando a controlo e células com baixas concentrações de Polidatina. No extratos, elevados nívewasde Polidatina está associados com altos nívewasdo rácio fosfocreatina/creatina (valor-p < 0.05) e baixa expressão de IDH 2 (valor-p < 0.01). Com o aumento da concentração de Polidatina a células apresentaram rácio lactato/alanina significativamente elevado (valor-p < 0.01), enquanto os nívewasde expresão de tioredoxina (valor-p < 0.0001), α-tubulina (valor-p < 0.001), e actina (valor-p < 0.01) eram significativamente baixos.Em suma, com a inibição da via das pentoses fosfato, existe um mudança no estado redox da célula, em vez de uma mudança no metabolismo da glucose, resultando numa aumento da atividade de espécies reativas de oxigénio, levando a um decrescimo do crescimento e proliferação de CHC, suportando o papel da via das pentose fosfato com forma de tratamento para o CHC.