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https://hdl.handle.net/10316/102957
Título: | The therapeutic potential of niraparib in lymphoid malignancies | Outros títulos: | O potencial terapêutico do niraparib em neoplasias linfóides | Autor: | Silva, Ana Patrícia Portelinha da | Orientador: | Gonçalves, Ana Cristina Pereira Palmeira, Carlos Manuel Marques |
Palavras-chave: | Instabilidade genómica; Resposta às lesões de DNA; Neoplasias linfóides; Letalidade sintética; Niraparib; Genomic instability; DNA damage response; Lymphoid malignancies; Synthetic lethality; Niraparib | Data: | 12-Set-2022 | Título da revista, periódico, livro ou evento: | The therapeutic potential of niraparib in lymphoid malignancies | Local de edição ou do evento: | Laboratório de Oncobiologia e Hematologia, Faculdade de Medicina, Universidade de Coimbra | Resumo: | A lesão do DNA pode ser induzida por fontes endógenas (por exemplo: reações enzimáticas, modificações químicas, erros na replicação) e exógenas (p.ex. radiação ultravioleta, radiação ionizante, químicos genotóxicos). Estas lesões, se não forem reparadas, podem induzir mutações, alterações cromossómicas, carcinogénese, morte celular e instabilidade genómica, sendo esta um dos hallmarks do cancro. A resposta à lesão do DNA é constituída por um conjunto de proteínas que detetam, sinalizam e/ou reparam as lesões de DNA. Este mecanismo coordena a progressão do ciclo celular com a reparação de DNA de modo a minimizar a transmissão de lesão para as células-filha. De modo a minimizar as lesões, as células desenvolveram mecanismos de reparação específicos para cada tipo de lesão. Os principais mecanismos são: via de reparação de excisão de base (BER), via de reparação de excisão de nucleótidos (NER), via de reparação de erros no emparelhamento de bases (MMR) e a reparação de quebras de cadeia dupla (reparação por recombinação homóloga (HRR) e união de extremidades não homólogas (NHEJ)), sendo as polimerases poli(ADP)-ribose 1/2 (PARP1/2) importantes intervenientes nestes mecanismos. No sistema hematopoiético, a reparação eficiente da lesão no DNA tem diversas funções na manutenção das diferentes linhagens celulares. Mutações ou desregulação de proteínas relacionadas com a reparação do DNA são observadas em neoplasias linfóides, nomeadamente nas neoplasias da célula B, como a leucemia linfoblástica aguda (LLA), a leucemia linfocítica crónica (LCC) e o mieloma múltiplo (MM). Com o conhecimento mais profundo da biologia da reparação e lesão do DNA na oncologia, novos tratamentos que exploram o stress replicativo através da inibição da reparação do DNA estão a ser desenvolvidas, sendo muitos deles baseados na letalidade sintética. Esta abordagem tem como alvo as células tumorais com alterações nas vias de reparação de DNA, enquanto preserva as células normais com reparação eficiente.Este projeto tem como objetivo caracterizar as lesões de DNA e a sua reparação em neoplasias linfóides, nomeadamente ALL, CLL e MM, e explorar o potencial terapêutico do Niraparib, um inibidor do PARP1/2, em modelos in vitro destas neoplasias.De modo a alcançar estes objetivos, utilizaram-se três linhas celulares de neoplasias linfóides: 697 (células de LLA), HG-3 (células de LLC) e U-266 (células de MM).A lesão do DNA e a sua reparação foram caracterizadas através do ensaio dos micronúcleos, com bloqueio da citocinese, com e sem exposição ao peróxido de hidrogénio. Além disso, as células foram incubadas na ausência e presença de diferentes concentrações de Niraparib. Os efeitos citostáticos e citotóxicos foram avaliados durante 72 horas com recurso ao ensaio do azul tripano. A distribuição das células pelas fases do ciclo celular foi determinada por citometria de fluxo usando uma solução de iodeto de propídio/RNAse. A morte celular foi avaliada por citometria de fluxo com recurso à anexina-V/7-AAD e por microscopia ótica (coloração May-Grünwald-Giemsa). Os resultados foram analisados estatisticamente, considerando um nível de significância de 95%.A linha celular HG-3 apresentou os níveis de lesão cromossómica basal mais elevados, enquanto a linha 697 apresentou a menor quantidade. O biomarcador de lesão cromossómica observado em maior frequência em todas as linhas celulares foi o micronúcleo. De modo a avaliar a cinética de reparação, as células foram avaliadas durante 48 horas após serem expostas a H2O2. Estes resultados demonstraram que a células HG-3 e U-266 apresentaram níveis mais elevados de lesão cromossómica, sendo o pico de lesão observado às 24 horas. No entanto, enquanto as células HG-3 conseguem reverter os níveis iniciais de lesão após as 48 horas, as células U-266 não conseguem. O niraparib em monoterapia inibiu a proliferação e viabilidade celulares de modo dependente da dose, tempo e linha celular. A U-266 foi a linha mais resistente ao Niraparib (IC50 = 57 µM), seguida da HG-3 (IC 50 = 55 µM) enquanto a 697 foi a mais sensível (IC50 = 2 µM). Além disso, o niraparib induziu morte celular por apoptose e um bloqueio do ciclo celular em fase G0/G1 nas células HG-3 e em fase G2/M nas células 697, as mais sensíveis ao Niraparib. Em conclusão, estes resultados sugerem que as linhas celulares de neoplasias da célula B têm diferentes perfis de lesão do DNA e de sensibilidade ao Niraparib, o que pode depender das características genéticas das linhas celulares cancerígenas uma vez que as células mais sensíveis são as que apresentam o gene BRCA1 mutado. Adicionalmente, uma caracterização dos mecanismos da resposta às lesões de DNA nestas linhas celulares e em amostras de doentes pode ajudar a selecionar os doentes que beneficiam da terapêutica com inibidores das vias de reparação. DNA damage can be induced by endogenous (e.g. enzymatic reactions, chemical modifications, replication errors) or exogenous (e.g. ultraviolet radiation, ionizing radiation, genotoxic chemicals) factors. The resulting defects, if left unrepaired, may induce cell mutations, chromosomal aberrations, carcinogenesis, cell death and genomic instability, one of the hallmarks of cancer. DNA damage response constitutes a network of proteins that sense, signal, and/or repair DNA damage. The DDR coordinates cell-cycle progression with DNA repair to minimize DNA damage being permanently passed to daughter cells, where PARP1/2 are key players. To counteract DNA damage, cells have evolved repair mechanisms, specific for many types of lesions. The major DNA repair mechanisms are BER, NER, MMR and DSB repair (HR and NHEJ). In the hematopoietic system, an efficient DDR serves essential functions in the maintenance of the cell lineages. Mutations or upregulation of proteins involved in DDR and repair are common in lymphoid malignancies, thus B-cell malignancies, such as acute lymphoblast leukemia (ALL), chronic lymphocytic leukemia (CLL) and multiple myeloma (MM). With greater understanding of the biology of DNA damage and repair in oncology, novel treatments that exploit replication stress via DDR inhibition are being developed, such as based in synthetic lethality. This approach pretends to target DNA-repair deficient tumors while sparing normal tissue in which DNA repair works correctly.This work aims to characterize DNA damage and repair signature in lymphoid malignancies, namely ALL, CLL and MM, and explore the therapeutic potential of niraparib, a PARP1/2 inhibitor, in in vitro models of these malignancies. To this end, three cell lines were used: 697 (ALL cell line), HG-3 (CLL cell line) and U-266 (MM cell line).DNA damage and repair activity characterization was assessed by cytokinesis-blocked micronucleus assay, without and with exposure to H2O2. Further, the cells were incubated in the absence and presence of increasing concentrations of niraparib (a PARP1/2 inhibitor) and the antiproliferation and cytotoxic effects of this DDR inhibitor were assessed using trypan blue assay for 72 hours. Cell cycle distribution was assessed by flow cytometry (FC) using propidium iodate/RNAse assay and cell death by annexin-V/7-AAD by FC as well as by optic microscopy (May-Grünwald-Giemsa staining). Results were statistical analysed, considering a significance level of 95%.Basal chromosomal damage was more present in HG-3 cell line, while 697 cell line had the lowest. MNi was the predominant chromosomal damage biomarker found in all cell lines. In order to evaluate the kinetics repair, cells were assessed during 48 hours after exposure to H2O2. It was possible to observe that HG-3 cells presented the higher levels of chromosomal damage and a peek of damage at 24 hours, whereas were able to revert to their initial levels of chromosome damage after 48 hours. Additionally, U-266 also presented a peek of damage at 24 hours but did not revert to their initial levels of damage after. However, 697 cells presented the lowest levels of chromosomal damage and it remained almost constant during the 48 hours, suggesting that repair is not efficient in these cells.The results from monotherapy studies with niraparib revealed a reduction of cell proliferation and viability in a dose-, time- and cell line-dependent manner. U-266 was the most resistant cell line (IC50 57 M), followed by HG-3 (IC50 55 µM) and 697 was the most sensitive (IC50 2 µM). Cell death evaluated by FC revealed that niraparib sparked a significant decrease in viable cells and increase in apoptotic cells, mainly with the administration of the higher doses, confirmed by optical microscopy by observing the morphological effects of the cells. Regarding cell cycle distribution, niraparib induces a blockage in the G0/G1 phase in HG-3 cells and a G2/M phase arrest in the most sensitive cells to niraparib, 697. In conclusion, these results suggest that B-cell malignancies cell lines have different DNA damage profiles and sensitivity to niraparib which may depend on the genetic characteristics of the cancer cells, since the ones that are more susceptible to the compound have a mutation on BRCA1 gene. Additionally, a further characterization of DDR pathways in these cell lines and in patient samples may help select the patients that will benefit from DDR inhibitors. |
Descrição: | Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia | URI: | https://hdl.handle.net/10316/102957 | Direitos: | embargoedAccess |
Aparece nas coleções: | UC - Dissertações de Mestrado |
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