Targeting Neuroinflammation: from target validation to rational design of selective modulators

Abstract

The modulation of neuroinflammation has been increasingly recognized as a viable approach to slow down or even halt the progression of several disorders of the central nervous system (CNS), such as Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, amyotrophic lateral sclerosis, multiple sclerosis, among others. The search for therapeutic molecules targeting microglia – the immune cells of the CNS – has been gaining momentum in the field of neurodegeneration, not only to decipher the molecular mechanisms of microglia-mediated neurotoxicity but also to find promising targets to reach the limelight of clinical research. One of the most important group of cytokines implicated in neuroinflammation is the interleukin 1 (IL-1) family, a well-characterized cluster that plays a critical role in inflammatory responses. Importantly, a growing body of evidence is showing that blocking the IL-1 signalling pathway via interleukin-1 receptor type 1 (IL-1R1) reduces neuroinflammation and delays disease progression. Notably, while there is a substantial body of research on the effects of IL-1R1 in such pathological processes, no small molecule modulators of this receptor have been reported to date. This project focused on the modulation of harmful neuroinflammatory responses associated with specific microglia subtypes, using IL-1R1 as a model target, via small molecules discovered through computational techniques and tested in human CHME3 microglial cell lines. The first goal was to identify and prioritize regions in the IL-1R1 ectodomain (ECD) surface prone to small-molecule binding, using three binding site prediction algorithms. The predictive druggability landscape analysis of IL-1R1 led to the identification of two potential druggable regions that may disturb pro-inflammatory cytokine binding. Given that IL-1R1 regulates IL-1 signalling in two forms - as a membrane-bound form and as a soluble ECD – the conformational dynamics of these two forms, with particular focus on a particular predicted binding site, was studied and compared by long timescale all-atom molecular dynamics (MD) simulations. These simulations revealed that major differences between the two IL-1R1 forms appear to be mainly governed by rearrangements of the linker connecting the D2 and D3 domains of the ECD, leading to different structure-dynamics behaviours. Representative protein conformations of both forms were extracted from the MD runs based on physicochemical features of the IL-1R1 binding site. The amount of structural data generated by the MD simulations coupled with experimental data motivated the implementation of an integrated structure-based virtual screening (VS) protocol targeting the ECD of IL-1R1, combining (i) three-dimensional (3D) pharmacophore modelling, (ii) clustering by maximum common substructures (MCS), (iii) molecular docking, and (iv) 3D shape similarity. Six receptor-based pharmacophore hypotheses were generated on the IL-1R1 binding site, which allowed the retrieval of 27.206 virtual hit compounds from a CNS-tailored virtual screening deck of 19.3 million compounds. As a post-screening filter, said screening hits were docked into IL-1R1, with the best candidates ranked via quantitative analysis of protein-ligand interactions and pharmacophore fitness levels. Twenty-one commercially available compounds were selected based on the best docking results and 3D shape similarity to a dataset of compounds exhibiting relevant bioactivity data, and taking in consideration chemical diversity. Compounds were acquired from their respective chemical vendors for in vitro evaluation. The selected compounds sought out by the VS campaign were evaluated in vitro in terms of aqueous solubility and cytotoxic activity in human HepG2 cancer cell lines and CHME3 microglial cell lines. Thereupon, microglia-based phenotypic screenings were employed to search for small molecules able to modulate the effects of microglial pro-inflammatory activation. Three compounds displaying the best solubility and toxicity profiles were tested at 20 μM in human CHME3 microglia after activation with a pro-inflammatory cytokine interferon-γ (IFN-γ). Two compounds were able to prevent upregulation of the inflammatory axis IL-1R1/IL-1β/IL-6/NRLP3/iNOS in microglia upon incubation with IFN-γ, as well as to reduce IFN-γ-induced activation of nuclear factor-kappa B (NF-κB). Our findings point out that these compounds exert regulatory effects in microglia polarization by potentially inhibiting the IL-1R1/Myd88/NF-κB signalling pathway. To sum up, this project was pioneer in discovering small molecule modulators of microglia-induced neuroinflammation, via an integrated medicinal chemistry approach encompassing the utilisation of computational methods and in vitro studies in human microglia. As a result, two molecular entities that modulate microglial pro-inflammatory markers and autocrine/paracrine signalling mediators have been discovered. Considering the current advanced state of this project, we firmly believe that the results achieved herein gathers conditions to “hit-the-ground running” for modulating microglia pro-inflammatory phenotypes and uncontrolled neuroinflammatory processes.

A modulação da neuroinflamação tem sido cada vez mais reconhecida como uma abordagem viável para retardar ou mesmo parar a progressão de várias doenças do sistema nervoso central (SNC), como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, esclerose lateral amiotrófica, esclerose múltipla, entre outras. A procura de moléculas com potencial terapêutico direcionadas à microglia - as células imunes do SNC – tem vindo a despertar atenção no campo da neurodegeneração, não apenas para decifrar os mecanismos moleculares de neurotoxicidade mediados pela microglia, mas também para encontrar alvos terapêuticos que possam alcançar a prática clínica. Um dos grupos de citocinas mais importantes implicado na neuroinflamação é a família da interleucina-1 (IL-1), um conjunto que desempenha um papel fundamental nas respostas inflamatórias. Vários estudos têm vindo a demonstrar que o bloqueio da via de sinalização da IL-1 através do recetor tipo 1 da interleucina-1 (IL-1R1) leva à redução da neuroinflamação e retarda a progressão de doença. Curiosamente, embora exista um grande conjunto de estudos sobre o IL-1R1, até ao momento não foram reportadas pequenas moléculas moduladoras da sua atividade biológica. O propósito subjacente a este projeto centra-se na modulação de respostas neuroinflamatórias prejudiciais devidas a fenótipos polarizados da microglia, usando o IL-1R1 como modelo de estudo principal, através de pequenas moléculas identificadas com o auxílio de métodos computacionais de descoberta de fármacos e testadas em linhas celulares de microglia humana CHME3. O primeiro objetivo consistiu em identificar e priorizar regiões à superfície do domínio extracelular (ECD) do IL-1R1 com tendência para ligarem pequenas moléculas, usando três algoritmos de previsão de locais de ligação. A análise preditiva de locais de ligação no IL-1R1 levou à identificação de duas regiões propensas à interação com pequenas moléculas, que após a ligação, podem perturbar a interação das citocinas pro-inflamatórias. Dado que o IL-1R1 regula a sinalização da IL-1 sob duas formas – como uma forma transmembranar e como um ECD solúvel – a variabilidade conformacional destas duas formas, com particular foco num local de ligação previsto, foi estudada e comparada através de simulações de dinâmica molecular (DM). Estas simulações revelaram que as principais diferenças entre as duas formas do IL-1R1 parecem ser devidas, em grande parte, a rearranjos conformacionais do “linker” localizado entre os domínios D2 e D3 do ECD, o que por sua vez leva a diferentes comportamentos estrutura-dinâmica. Conformações proteicas representativas de ambas as formas foram extraídas das corridas de DM com base em características físico-químicas do local de ligação do IL-1R1. A quantidade de estruturais gerados pelas simulações de DM juntamente com dados experimentais motivou a implementação de um protocolo de rastreio virtual (VS), baseado na estrutura, direcionado ao ECD do IL-1R1, que integra (i) modelação tridimensional (3D) de farmacóforos, (ii) agrupamento de estruturas químicas com base na máxima subestrutura comum (MCS), (iii) acoplamento molecular, e (iv) pesquisas de similaridade tridimensionais baseadas na forma. Inicialmente, 6 hipóteses de farmacóforo foram construídas usando o local de ligação previsto do IL-1R1, o que permitiu identificar 27,206 compostos a partir de uma biblioteca virtual personalizada de 19,3 milhões de moléculas previstas passarem a barreira hemato-encefálica e chegarem ao SNC. Este conjunto de compostos foi sujeito a estudos de acoplamento molecular, e filtrados por meio de análise quantitativa de interações proteína-ligando e níveis de complementaridade com o farmacóforo. Foram selecionados 21 compostos disponíveis comercialmente com base nos melhores resultados de acoplamento molecular e pesquisas de similaridade 3D contra um conjunto de compostos com dados de bioatividade relevantes, tendo em consideração a diversidade química. Para validar o trabalho computacional executado, os compostos foram adquiridos aos respetivos fornecedores para avaliação in vitro. Os compostos selecionados através do protocolo de VS foram testados experimentalmente in vitro para averiguar a sua solubilidade aquosa e atividade citotóxica em linhas celulares de hepatoma humano (HepG2) e de microglia humana CHME3. Em seguida, foram realizados ensaios fenotípicos na microglia a fim de identificar compostos capazes de modular os efeitos da ativação pro-inflamatória da microglia. Os três compostos com melhores perfis de solubilidade e toxicidade foram testados na concentração de 20 μM na microglia CHME3 após ativação com a citocina pró-inflamatória interferão-gama (IFN-γ). Destes, dois compostos demonstraram capacidade para reverter a indução de mediadores pro-inflamatórios IL-1R1/IL-1β/IL-6/NRLP3/iNOS juntamente com uma redução de ativação do NF-κB na microglia após incubação com IFN-γ. Os nossos resultados indicam que estes compostos exercem efeitos reguladores na polarização da microglia possivelmente através da inibição da via de sinalização IL-1R1/Myd88/NF-κB. Em suma, este projeto foi pioneiro em descobrir compostos moduladores da neuroinflamação mediada pela microglia, através uma abordagem integrada de química medicinal que incorpora a utilização de métodos computacionais e estudos in vitro em microglia humana. Como resultado, foram descobertas duas entidades moleculares que modulam os marcadores pro-inflamatórios da microglia e mediadores para sinalização parácrina e autócrina. Considerando o atual estado avançado deste projeto, acreditamos que os resultados aqui mencionados reúnem condições para o desenvolvimento de novas moléculas moduladoras da fenótipos pro-inflamatórios da microglia e neuroinflamação descontrolada.