Early autophagy dysfunction in Alzheimer's disease: the role of WIPI2

Abstract

A doença de Alzheimer (DA) é uma patologia neurodegenerativa crónica e progressiva que afecta o bem-estar físico, psicológico e social de quase 50 milhões de pessoas em todo o mundo, incluindo 6% da população portuguesa acima de 60 anos. A DA é caracterizada pela acumulação de placas neuríticas, contendo o peptídeo beta-amilóide (Aβ), e de tranças neurofibrilares da proteína Tau. A doença é também acompanhada por perda sináptica, degeneração axonal e morte neuronal, resultando em défices cognitivos e de memória. A acumulação patológica de proteínas é pronunciada na DA, o que sugere que a macroautofagia (doravante denominada autofagia) desempenha um papel fundamental na patogénese da doença. A autofagia é um sistema de degradação e reciclagem de componentes celulares em células eucarióticas. Esses componentes são inicialmente rodeados por vesículas com dupla membrana denominadas de autofagossomas, que depois se fundem com lisossomas iniciando a degradação do seu conteúdo. Este é um processo fortemente regulado por uma série de proteínas envolvidas na autofagia (ATG), que por sua vez são recrutadas por outra proteína (i.e. WIPI), caracterizada pela presença da repetição do domínio triptofano-ácido aspártico (WD), que interage com fosfoinositois e dessa forma controla a formação do autofagossoma. A autofagia ocorre constitutivamente nos neurónios, inclusivamente no cone de crescimento axonal e nos locais sinápticos, existindo diferenças notáveis entre a autofagia dendrítica e axonal. Contudo, as alterações na autofagia intra-axonal no contexto da DA são ainda pouco compreendidas.Estudos recentes indicam que os autofagossomas sofrem modificações com a idade e que o decaímento na sua produção pode ser restaurado, se manipulado extrinsecamente. Com base nestas evidências e em alguns resultados preliminares prévios, colocámos a hipótese de que oligómeros de Aβ (AβO) podem afetar a biogénese dos autofagossomas a nível intra-axonal nas fases iniciais da DA, que este poderá ser um dos primeiros efeitos dos AβOs, e que este mecanismo poderá exacerbar o efeito do envelhecimento na autofagia a nível dos axónios. Isto poderá explicar a disfunção sináptica induzida por AβO observada antes que qualquer dano celular seja detetável, suportando a ideia de que um aumento modesto da autofagia talvez possa ser suficiente para neutralizar a agregação de proteínas ao longo do tempo, sem efeitos colaterais consideráveis.Assim, os principais objetivos desta tese foram estudar: 1) o efeito dos AβO na biogénese dos autofagossomas; 2) as vias de sinalização envolvidas na disfunção intra-axonal da autofagia induzida pelos AβO; 3) o efeito dos AβO no transporte axonal dos autophagosomas. Resumidamente, os resultados obtidos mostram que os níveis de autofagia intra-axonal são alterados em resposta à estimulação de neurónios do hipocampo com AβO. A análise quantitativa de proteínas ligadas às etapas iniciais da biogénese do autofagossoma revelou alterações significativas durante as fases iniciais da DA, tanto na porção distal do axónio como nas regiões pré-sinápticas. Em particular, descobrimos que os AβOs aumentam a fosforilação da proteína WIPI2 e os seus níveis totais, o que se espera que tenha um impacto no alongamento e na selagem/ fecho do autofagossoma. Os resultados também indicaram que a exposição aos AβOs induz, em primeiro lugar, uma reorganização de proteínas relacionadas à autofagia, que, juntamente com as mudanças observadas no estado de fosforilação de WIPI2, podem indicar a formação de estruturas autofagossómicas aberrantes, conforme evidenciado em estudos anteriores. Dada a importância da fosforilação da WIPI2 como regulador molecular da formação de autofagossomas, este trabalho também se focou na identificação e caracterização de participantes envolvidos neste mecanismo molecular. O nosso estudo mostrou que a toxicidade induzida por AβO afeta esta via de sinalização e que a resposta é mediada não só pelo receptor N-metil-D-aspartato (NMDA) mas também pela proteína quinase II dependente de cálcio / calmodulina (CaMKII). Diante dos resultados obtidos, a última parte deste trabalho focou-se no transporte axonal de autofagossomas, para entender de que forma essas alterações na biogénese do autofagossoma podem também regular e influenciar a motilidade dessas vesículas na porção distal do axónio. Nesta parte do trabalho, descobrimos que os AβOs aumentam o número de autofagossomas imaturos na porção distal do axónio, influênciam o seu transporte e induzem movimentos aleatórios do autofagossoma. Isto indica que a incubação de neurónios do hipocampo com AβOs, não regula apenas as proteínas ATG, mas também afeta o correcto transporte dos autofagossomas ao longo dos axónios.De uma forma geral, mostrámos que a proteína WIPI2 é um alvo muito promissor para estudos futuros sobre a DA e que a sua fosforilação pode ser um alvo terapêutico potencialmente importante para esta doença neurodegenerativa.

Alzheimer’s disease (AD) is a chronic and progressive neurodegenerative disorder that affects the physical, psychologic and social well-being of nearly 50 million people worldwide, including 6% of the Portuguese population over 60 years old. The most common hallmarks of AD, besides extracellular amyloid-beta (Aβ) accumulation and neurofibrillary tangles, are synaptic loss, axonal degeneration and neuronal death, resulting in memory and cognitive deficits. Since the pathological accumulation of proteins is pronounced in AD, it has been suggested that macroautophagy (henceforward termed autophagy) plays a role in the pathogenesis of the disease. In fact, autophagy dysfunction has been associated to several neurodegenerative disorders. Autophagy is a system for degradation and recycling of cellular components in eukaryotic cells. These cellular wastes are initially engulfed by double-membraned vesicles called autophagosomes, which then fuse with lysosomes initiating the degradation of their content. This is a highly regulated process by a series of proteins defined as autophagy-related (ATG) proteins, which can be recruited by a tryptophan-aspartic acid (WD) repeat protein interacting with phosphoinositides (WIPI) that controls autophagosome formation. Bulk autophagy occurs constitutively in neurons throughout development, in a spatially localized manner in the growth cone and at synaptic sites and, interestingly, there are remarkable differences between dendritic and axonal autophagy. Noteworthy, the mechanisms involved in intra-axonal autophagy in the context of AD, which has implications in axonal viability, are still poorly understood.Recent evidence demonstrated that autophagosomes suffer modifications with age and that the decay in autophagosome production can be restored, if extrinsically manipulated. Based on this evidence and in some previous preliminary results from our laboratory, we hypothesized that Aβ Oligomers (AβO) may impair intra-axonal autophagosome biogenesis in early phases of AD and this may be one of the first effects of AβO, exacerbating the effect of aging with a consequent impairment of the axonal function. This might explain how AβO can induce synaptic failure before any cell damage is detectable and raises the idea that perhaps a modest increase in autophagy could be sufficient to counteract protein aggregation over time, without considerable deleterious side effects.Therefore, the main goals of this thesis were to study: 1) the effects of AβO on autophagosome biogenesis; 2) the pathways involved in AβO-induced dysfunction of intra-axonal autophagy; 3) the effect of AβO on the axonal transport of autophagosomes along the axon.Briefly, the results obtained demonstrate that the presence of AβO changes the levels of intra-axonal autophagy. Quantitative analysis of proteins linked to the initial steps of the autophagosome biogenesis revealed significant alterations during the early stages of AD, both in the distal portion of the axon and at presynaptic regions. In particular, we found that AβO increases WIPI2 protein phosphorylation and total levels, which is expected to have an impact on autophagosome elongation and sealing. The results also indicated that exposure to AβO induces, first, a reorganization of autophagy-related proteins, which, together with the observed changes in the phosphorylation state of WIPI2, might indicate the formation of aberrant autophagosomal structures, as evidenced in previous studies. Given the importance of WIPI2 phosphorylation as a molecular switch for autophagosome formation, this work also focused on the characterization of the players involved in this molecular mechanism. Our study showed that not only AβO-induced toxicity affects this signaling pathway but also that the response is mediated by both N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor and calcium / calmodulin-dependent protein kinase II (CaMKII). In light of the results obtained, the last part of this our work focused on the axonal transport of autophagosomes, to understand how these alterations in autophagosome biogenesis can also regulate and influence the motility of these vesicles in the distal portion of the axon. In this part of the work we found that AβO increases the number of immature autophagosomes in the axonal distal portion, influences their transport and induces autophagosome random movements. This indicates that incubation of hippocampal neurons with AβOs, not only regulates ATG proteins but also affects autophagic transport at the early stages of its toxicity.Together, we show that WIPI2 is a very promising protein for future studies in AD and that its phosphorylation might be an interesting potential therapeutical target for this neurodegenerative disorder.