Permeation of Weak Acids and Bases Through Lipid Bilayers – Modelling and Validation of a pH Variation Assay

Abstract

A descoberta e desenvolvimento de fármacos é um processo iterativo e muito complexo. A insuficiente absorção, distribuição, eliminação, eficácia e segurança dos candidatos a fármacos são os principais obstáculos no desenvolvimento de novas terapias. As membranas lipídicas são a principal barreira à difusão dos solutos e determinam a disponibilidade destes compostos nos tecidos. Prever a velocidade de permeação de solutos in vivo é crucial, e existem vários estudos in vitro para entender e quantificar esse processo. O ensaio de variação de pH é particularmente relevante porque permite seguir a permeação de ácidos e bases fracas, mesmo quando estes não apresentam propriedades óticas. No entanto, existem alguns artefactos, a validade deste ensaio não é amplamente aceite e os coeficientes de permeabilidade nem sempre são consistentes com aqueles obtidos por outros métodos.Neste trabalho foi desenvolvido um modelo cinético para a permeação de ácidos e bases fracos através de membranas lipídicas que considera explicitamente os dois folhetos da membrana. As simulações desses processos permitiram identificar alguns princípios do desenho experimental necessários para não comprometer a precisão do método na previsão dos coeficientes de permeabilidade. Devem ser utilizadas vesículas lipídicas de grandes dimensões e a variação de pH deve ser inferior a 0.25 unidades. Estas conclusões resultaram da análise do efeito da topologia do sistema, da lipofilicidade do soluto e das concentrações do soluto e da sonda de fluorescência nos números de ocupação por vesícula e da comparação da dinâmica de permeação do soluto e da variação da fluorescência. Ao analisar o efeito destes parâmetros no coeficiente de permeabilidade, verificou-se que a equação comummente utilizada Papp = β × r/3 é inadequada para avaliar o coeficiente de permeabilidade de ácidos e bases fracas. Isso resulta do facto de vários pressupostos e aproximações considerados na derivação desta equação não serem válidos nas condições do ensaio.Este trabalho também se focou na análise do efeito de vários parâmetros (constante de velocidade de translocação, pKa do soluto, permeabilidades de protão e do potássio) na cinética de permeação do soluto e na variação do pH interno resultante. A permeação de ácidos fracos resulta numa rápida diminuição do pH, seguida de uma recuperação mais lenta do seu valor inicial. Na permeação de bases fracas é observado um efeito simétrico. Se apenas a espécie neutra permear a membrana, a dinâmica do soluto é bem descrita por uma função monoexponencial. No entanto, se a permeação das espécies carregadas for incluída (ainda que num processo mais lento), a acumulação de soluto pode seguir uma cinética bifásica. Neste caso, a permeabilidade aparente do soluto deve ser calculada a partir de uma constante característica média (α1 β1 + α2 β2). Porém, não é possível calculá-la com precisão a partir da dinâmica de fluorescência, uma vez que não existe uma relação direta entre as constantes características e os termos pré-exponenciais. Usar apenas a constante característica do processo rápido resultará numa sobrestimação do coeficiente de permeabilidade ao soluto. A fase lenta da permeação do soluto não é influenciada apenas pela permeabilidade das espécies de soluto carregadas, mas também pela permeabilidade de outras espécies carregadas em solução como H+/OH‒ e os outros iões responsáveis pela dissipação do potencial eletrostático, gerado pelo desequilíbrio de carga.Foram realizadas algumas experiências de equilíbrio de pH para estimar a permeabilidade dos iões H+/OH‒ e avaliar o efeito da valinomicina, um ionóforo com alta especificidade para K+. No entanto, estes objetivos não foram alcançados com sucesso, uma vez que os resultados experimentais obtidos eram bastante diferentes das variações previstas pelo nosso modelo cinético. Concluiu-se que as discrepâncias se devem principalmente à capacidade tampão de pH adicional presente no interior das vesículas, possivelmente devido à presença de ácido carbónico. O aumento da capacidade tampão resulta na necessidade de permeação de uma maior quantidade de iões H+/OH‒ para reestabelecer o equilíbrio de pH, o que, por sua vez, leva ao desenvolvimento de um maior desequilíbrio de cargas entre os meios aquosos externo e interno das vesículas. Assim, o potencial eletrostático gerado opõe-se ao movimento dos iões H+/OH‒ e impede o reequilibrar do pH. O completo reequilíbrio requer o movimento adicional de cargas, como K+ na presença de valinomicina, o que explica o forte efeito da valinomicina observado experimentalmente.

Drug discovery and development is an iterative and very complex process. The poor absorption, distribution, clearance, efficiency, and safety of drug candidates are the major pitfall in the development of new therapies. Lipid membranes represent the main barrier to the free diffusion of solutes and determine the availability of these compounds in the tissues. Predicting the rate at which solutes permeate in vivo barriers is crucial, and there are several in vitro studies valuable for this goal. The pH-variation assay is particularly relevant because it allows following the permeation of weak acids and bases even when they do not exhibit optical properties. However, there are some artefacts, its validity is not widely accepted, and the permeability coefficients are not always consistent with those from other methods.In this work, a kinetic model was developed for the permeation of weak acids and bases through lipid membrane barriers that considers explicitly the two membrane leaflets. The simulations of these processes were able to identify some experiment design principles to not compromise the accuracy of the method in the prediction of permeability coefficients. The assay must be employed with larger vesicles, and the pH variation must be under 0.25 units. These conclusions were achieved by analysing the effect of the topology of the system, solute lipophilicity, and solute and fluorescent pH probe concentrations on the occupancy numbers per vesicle and by comparing the dynamics of solute accumulation and fluorescence variation. When analysing the effect of these parameters on the permeability coefficient it was found that the widely used equation Papp = β × r/3 is inappropriate to assess the permeability coefficient of drug-like weak acids and bases. This results from the failure of several assumptions and approximations considered in the derivation of this equation.This work also examined the effect of several parameters (flip-flop rate constant, solute’s pKa, proton, and potassium permeabilities) on the kinetics of solute permeation and the resulting pH variation inside the vesicles. The permeation of weak acids leads to a fast decrease of the pH, which is followed by a slow recovery to the initial pH value, and a symmetric effect is observed for the permeation of weak bases. If only the neutral solute species may permeate the membrane, the solute equilibration is well described by a mono-exponential function. However, if permeation of charged species is included (albeit as a slower process), the accumulation of solute may follow a biphasic kinetics. In this case, the solute apparent permeability should be calculated from a weighted characteristic constant (α1 β1 + α2 β2). However, when using the fluorescence dynamics, this is not possible to perform accurately due to a non-direct relationship between the characteristic constants and pre-exponential terms. When using only the characteristic constants of the fast process, the solute permeability coefficient is overestimated. It was observed that the slow phase in solute accumulation is not influenced only by the permeability of the charged solute species, but also by the permeability of other charged species in solution such as H+/OH‒ and the ions responsible for the dissipation of electrostatic potentials generated by charge unbalance.Some pH equilibration experiments were performed to estimate the permeability of H+/OH‒ and assess the effect of valinomycin, an ionophore with high specificity for K+. However, our objectives were not successfully achieved as the experimental results obtained were quite different from the time courses predicted by our kinetic model. We concluded that the main reason for the discrepancies was the additional pH buffer capacity present inside the vesicles, possibly due to the presence of carbonic acid. The increased buffer capacity leads to a higher amount of H+/OH‒ required to achieve pH equilibration, which in turn leads to the development of a larger charge unbalance between the aqueous media inside and outside the vesicles. The electrostatic potential thus generated hinders the movement of additional H+/OH‒ and prevents pH equalisation. The full equalization requires the countermovement of additional charges, such as K+ in the presence of valinomycin, which explains the strong effect of valinomycin observed experimentally.