Unraveling the role of P2Y1 receptor and CRMP2 in Aβ-synaptotoxicity

Abstract

A doença de Alzheimer (DA) é uma doença neurodegenerativa que causa a perda progressiva de funções cognitivas. As principais características histopatológicas da DA são a acumulação extracelular do peptídeo β-amiloide (Aβ) e a agregação intracelular de tau hiperfosforilada. Contudo, a perda sináptica correlaciona melhor com os défices cognitivos que ocorrem nesta doença. Os oligómeros de Aβ constituem a forma mais tóxica de Aβ e contribuem ativamente para a disfunção e perda sináptica. No entanto, os mecanismos subjacentes à perda sináptica induzida pelo Aβ que sustentam a perda progressiva de funções cognitivas são apenas parcialmente compreendidos. O recetor P2Y1 (P2Y1R), um recetor acoplado à proteína G pertencente ao subtipo de recetores de ATP P2, parece estar envolvido na perda de sinapses e de memória induzida pelo Aβ, dado que o Aβ aumenta os níveis extracelulares de ATP e a densidade sináptica do P2Y1R, e o bloqueio ou o silenciamento do P2Y1R impede a perda sináptica e os danos na memória causados pelo Aβ. Possivelmente, isto pode dever-se ao papel desempenhado por este recetor na neurodegeneração induzida por glutamato, na qual o P2Y1R promove um aumento seletivo de recetores de NMDA (NMDAR) no axónio e, consequentemente, maior influxo de Ca2+, dano do citoesqueleto axonial mediado pela calpaína e perda sináptica. De acordo com isto, o Aβ induz a acumulação de glutamato, a ativação excessiva de NMDARs e a proteólise mediada por calpaína. Por outro lado, o P2Y1R regula a fosforilação da proteína mediadora da resposta à colapsina 2 (CRMP2). Esta proteína encontra-se hiperfosforilada em cérebros humanos e modelos animais da DA e a perda de memória causada pelo Aβ envolve a fosforilação da S522 da CRMP2. Para além disso, a CRMP2 pode modular o tráfego e a atividade de NMDARs e a sua fosforilação na T555 é necessária para a perda de integridade axonial induzida por glutamato e mediada pelos NMDARs. Deste modo, propusemos a hipótese que o Aβ induz a perda sináptica através de um aumento de NMDARs no axónio promovido pelo P2Y1R e mediado pela CRMP2, levando a um maior influxo de Ca2+ e à degeneração do axónio mediada pela calpaína.Neste trabalho, observámos em neurónios do hipocampo de rato que o Aβ1-42 aumentou a densidade de NMDARs no axónio e no corpo celular, o que não ocorreu na presença do antagonista seletivo do P2Y1R, MRS2500. Para além disso, o MRS2500 impediu a indução por parte do Aβ1-42 de danos no citoesqueleto e perda de sinapses. O silenciamento da CRMP2 em neurónios do hipocampo de rato diminuiu seletivamente os NMDARs no axónio e reduziu, no axónio distal, o influxo de Ca2+ pelos NMDARs induzido pelo Aβ1-42. As modificações no estado de fosforilação da CRMP2 foram também avaliadas. Os resultados obtidos em neurónios do hipocampo de rato e no córtex de murganhos C57/BL6J mostram que o Aβ1-42 regula a fosforilação da CRMP2 na T514, S522 e T555. Para além disso, observámos tanto in vitro como in vivo que o aumento induzido pelo Aβ1-42 na fosforilação da CRMP2 na T514 e T555 foi impedido pelo bloqueio farmacológico do P2Y1R. A densidade e a fosforilação da GSK3β, uma cinase que fosforila a CRMP2 na T514, foram também avaliadas neste estudo. Foi observado in vitro e in vivo que o Aβ1-42 causou um aumento na densidade da GSK3β e na sua fosforilação na Y216. No córtex de murganhos C57/BL6J, o Aβ1-42 causou também uma diminuição da fosforilação de GSK3β na S9. Para além disso, estas modificações induzidas pelo Aβ1-42 na densidade e no estado de fosforilação da GSK3β foram prevenidas pelo MRS2500.Em conjunto, estes resultados indicam que o Aβ provoca, através do P2Y1R, um aumento dos NMDARs nos axónios e no corpo celular, proteólise do citoesqueleto e perda sináptica. Para além disso, estes dados sugerem que a CRMP2 está envolvida no aumento dos NMDARs no axónio induzido pelo Aβ. Embora ainda não tenha sido estabelecida uma ligação entre a fosforilação da CRMP2 e a sua interação com os NMDARs, estes resultados mostram que o Aβ aumenta a fosforilação desta proteína na T514, S522 e T555, e que a fosforilação da T514 e T555 é dependente da ativação do P2Y1R. Para além disso, o aumento da fosforilação da CRMP2 na T514 pode resultar do aumento induzido pelo Aβ e mediado pelo P2Y1R da densidade e da atividade da GSK3β.

Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder that causes progressive cognitive decline. The key histopathological hallmarks of AD are the aberrant accumulation of extracellular amyloid-β (Aβ) and intracellular hyperphosphorylated tau. Nevertheless, synaptic loss is the best correlate of the cognitive deficits in this disorder. Aβ oligomers constitute the most toxic form of Aβ and actively contribute to synaptic dysfunction and loss. However, the mechanisms underlying Aβ-induced synaptic loss supporting the progressive cognitive deficits are only partially understood. The P2Y1 receptor (P2Y1R), a P2 ATP G-protein coupled receptor subtype, appears to be involved in A-induced synaptic and memory loss given that Aβ increases the extracellular levels of ATP and upregulates the synaptic density of P2Y1R, and blockade or genetic deletion of P2Y1R prevents Aβ-induced synaptic loss and memory impairment. Possibly, this could be due to the role played by this receptor in glutamate-induced neurodegeneration, in which P2Y1R promotes a selective increase in axonal NMDA receptors (NMDAR) and, consequently, enhances Ca2+ influx, calpain-mediated axonal cytoskeleton damage, and synapse loss. Notably, Aβ induces glutamate buildup and spillover, overactivation of NMDARs, and calpain-mediated proteolysis. On the other hand, P2Y1R regulates the phosphorylation of collapsin response mediator protein-2 (CRMP2). This protein is hyperphosphorylated in AD brains and animal models, and Aβ-induced memory impairment requires the phosphorylation of CRMP2 at S522. Also, CRMP2 can modulate the trafficking and activity of NMDARs and its phosphorylation at T555 is required for glutamate-induced, NMDAR-mediated loss of axonal integrity. Hence, we hypothesized that Aβ induces synaptic loss through a P2Y1R-driven, CRMP2-mediated increase in axonal NMDARs and consequent Ca2+-influx and calpain-mediated axonal damage.In the present work, we observed in rat hippocampal neurons that Aβ1-42 increased the density of axonal and somal NMDARs, but not in the presence of the selective P2Y1R antagonist, MRS2500. In addition, MRS2500 prevented Aβ1-42-induced cytoskeletal damage and synapse loss. We found that the knockdown of CRMP2 in rat hippocampal neurons provoked a selective decrease in axonal NMDARs and decreased Aβ1-42-induced NMDAR-mediated Ca2+-influx in the distal axon. Modifications in the phosphorylation state of CRMP2 were also evaluated. The results obtained in rat hippocampal neurons and in the cortex of C57/BL6J mice show that Aβ1-42 regulates the phosphorylation of CRMP2 at T514, S522, and T555. Furthermore, we found that the Aβ1-42-induced phosphorylation of CRMP2 at T514 and T555 was abrogated with the pharmacological blockade of P2Y1R both in vitro and in vivo. The density and phosphorylation of GSK3β, a kinase that phosphorylates CRMP2 at T514, were also assessed in this study. It was observed both in vitro and in vivo an Aβ1-42-induced increase in GSK3β density and phosphorylation at Y216. In the cortex of C57/BL6J mice, Aβ1-42 also decreased the phosphorylation of GSK3β at S9. Moreover, these Aβ1-42-induced modifications in the density and phosphorylation state of GSK3β were prevented by MRS2500. Altogether, these findings indicate that Aβ causes a P2Y1R-driven increase in axonal and somal NMDARs, cytoskeletal proteolysis, and synapse loss. Moreover, our preliminary data suggest that CRMP2 is involved in Aβ-induced increase in axonal NMDARs. Although a link between CRMP2 phosphorylation and its interaction with NMDARs is yet to be established, these results show that Aβ increases the phosphorylation of this protein at T514, S522, and T555, and the phosphorylation at T514 and T555 is dependent on P2Y1R activation. Furthermore, the enhanced phosphorylation of CRMP2 at T514 might be a result of Aβ-induced and P2Y1R-mediated upregulation of the density and activity of GSK3β.