Fructose metabolism and lipogenesis fluxes in mice models of diet-induced non-alcoholic fatty liver disease

Abstract

Non-alcoholic fatty liver disease, characterised as an abnormal accumulation of triglyceride in hepatocytes, is one of the most prevalent chronic liver disease globally in current times. It is associated with many metabolic disorders related to overfeeding including type 2 diabetes mellitus, insulin resistance, and hyperlipidemia. NAFLD represents a spectrum of liver diseases ranging from simple steatosis to steatohepatitis, fibrosis, cirrhosis and ultimately, hepatocellular carcinoma or liver failure. NAFLD has a multifactorial cause with genetic susceptibility and an unhealthy lifestyle playing a central role in its development. Hepatic de novo lipogenesis (DNL) may play an important role in the accumulation of lipids in the liver during NAFLD. Deuterated water (2H2O) is a widely used tracer for quantifying DNL rates in both animal models and humans. A major uncertainty of this method is that exchange of water hydrogens with those of fatty acid precursors and/or NADPH may be incomplete, resulting in under-estimates of DNL. In mice, we measured the 2H enrichment of fatty acid hydrogens in positions 2, 3 and terminal methyls from [U-2H7]glucose to determine 2H transfer from glucose to fatty acid via malonyl-CoA, NADPH, and acetyl-CoA, respectively. Our study indicates that glucose 2H are transferred at different fractional rates into the different fatty-acid sites during lipogenesis. Transfer of hydrogen from unlabeled glucose to fatty acids via NADPH was the most important factor in the non-stoichiometric incorporation of 2H into fatty acids during DNL. This information allows better modelling of lipid enrichment from 2H2O and also provides insight on NADPH sources for lipogenesis.

The pentose phosphate pathway (PPP) is an important component of hepatic intermediary metabolism, and is a key requirement for de novo lipogenesis since it generates NADPH equivalents for fatty acid synthesis and/or elongation. Recently, Jin et al developed an elegant 13C-NMR method for measuring hepatic PPP flux by quantifying the distribution of glucose 13C-isotopomers formed from [U-13C]glycerol. In chapter 3, we demonstrate this approach can be extended to exogenous [U-13C]fructose and [U-13C]glucose precursors by 13C-NMR analysis of glycogen. Our study revealed that the PPP preferentially utilized the glucose-6 phosphate generated via glucokinase and the direct pathway as compared to glucose-6-P obtained from indirect pathway precursors, such as [U-13C]fructose.

An excessive consumption of fat and/or fructose either as part of sucrose or in the form of high-fructose corn syrup results a higher accumulation of lipid in the liver, implicated in the surge of NAFLD development and pathogenesis. In chapter 4, we established mouse models to determine the contribution of fructose in high sugar and/or high fat diets to de novo synthesis of liver triglyceride in diet induced mice models of NAFLD. Mice were provided with a combination of deuterated water and [U-13C]fructose tracers. Our study showed that high-fat, high sugar and a combination of high fat and high sugar diets provided over an 18 week period resulted in significant increases in adiposity over standard chow for adult male C57BL6/J mice. Moreover, high sugar and high fat plus high sugar feeding resulted in significant increased hepatic TG levels that associated with elevated lipogenesis rates in which the fructose component contributed sizable fractions of both acetyl-CoA and glycerol-3-phosphate precursors. Thus, both the fat and sugar components of this diet contribute to hepatic steatosis in an additive manner.

O Fígado Gordo Não-Alcoólico (NAFLD), caracterizado por uma acumulação anormal de triglicerídeos nos hepatócitos, é uma das doenças crónicas associadas ao fígado mais prevalentes à escala global. É uma condição normalmente associada com diversas patologias metabólicas especialmente as relacionadas com dietas excessivas tais como Diabetes Mellitus tipo 2, resistência a insulina e hiperlipidémia. A NAFLD representa o espectro das doenças de fígado desde esteatose simples até esteatohepatite, fibrose, cirrose e, nos estágios mais avançados, em carcinoma hepatocelular e falência hepática. As causas para NAFLD são multifatoriais, tendo a suscetibilidade genética e estilos de vida menos saudáveis um papel central no seu desenvolvimento. A lipogénese de novo hepática (DNL) pode desempenhar um papel crucial de acumulação de lípidos no fígado durante progressão de NAFLD. A água deuterada (2H2O) é amplamente utilizada como marcador para quantificação das taxas de DNL em diversos modelos animais e também em humanos. Uma das maiores subjetividades deste método relaciona-se com a troca de hidrogénios da água com os ácidos gordos percursores e/ou o NADPH, que pode ser incompleta resultando em sub-estimação da DNL. Em modelos de ratinho, medimos o enriquecimento em 2H nos hidrogénios dos ácidos gordos, nas posições 2, 3 e grupos metilo terminais, provenientes do substrato externo [U-2H]glucose, por forma a determinar a transferência de 2H da glucose para os ácidos gordos, via malonil-coA, NADPH e acetil-CoA respetivamente. O nosso estudo indica que os 2H da glucose são transferidos para as diferentes posições dos ácidos gordos durante a lipogénese, a taxas fracionais diferentes. A transferência de hidrogénio da glucose não marcada para os ácidos gordos via NADPH, revelou-se o fator mais relevante na incorporação não-estequiométrica de 2H nos ácidos gordos durante a DNL. Esta informação permite assim uma modelação melhorada do enriquecimento lipídico do 2H2O providenciando ainda evidência das fontes de NADPH para a lipogénese.

A via das pentoses fosfato (PPP) é um importante componente do metabolismo intermédio hepático, sendo um requisito crucial para a lipogénese de novo, uma vez que gera equivalentes NADPH para a síntese de ácidos gordos e/ou elongação dos mesmos. Recentemente, Jin et al. desenvolveram um elegante método de 13C-NMR, para medir os fluxos PPP hepáticos, através da quantificação da distribuição de isotopómeros de glucose 13C formados através de [U-13C]glicerol. No capítulo 3 desta dissertação, demonstramos que este desenho experimental pode ser estendido e aplicado aos percursores exógenos [U-13C]glucose e [U-13C]frutose por análise 13C-NMR de glicogénio. Os nossos estudos revelaram que a PPP utiliza preferencialmente a glucose-6-fosfato gerada via glucokinase por via direta quando comparado com glucose-6-P obtida pela via dos percursores indiretos, tal como a [U-13C]frutose.

O consumo excessivo de gordura e/ou frutose, como parte da sacarose ou “high-fructose corn syrup” resulta no incremento da acumulação lipídica no fígado, que está presente no surgimento e progressão de NAFLD e evolução patológica. No capítulo 4, estabelecemos modelos de ratinho por forma a determinar a contribuição da frutose em dietas enriquecidas em açúcar e/ou gordura, para a síntese de novo de triglicerídeos no fígado, em modelos de ratinho NAFLD induzida por dieta. Aos ratinhos foi administrada uma combinação de marcadores de água deuterada e [U-13C]frutose. Os nossos resultados demonstraram que dietas enriquecidas em gordura, açúcar e uma combinação destes dois, providenciados durante um período de 18 semanas, resultaram num aumento significativo da adiposidade em comparação com ratinhos adultos C57BL6/J alimentados com dieta standard. Adicionalmente, dietas enriquecidas em açúcar e gordura mais açúcar, levaram a um incremento significativo dos níveis de TG hepáticos, correlacionando-se com taxas de lipogénese aumentadas, em que a frutose se revelou como componente contributivo significativo para as frações dos percursores acetil-CoA e glicerol-3-fosfato. Desta forma, ambos os substratos, açúcar e gordura, nestas dietas, contribuíram para a esteatose hepática de modo aditivo.