INULIN PARTICLES AS A VACCINE ADJUVANT FOR HEPATITIS B. DEVELOPMENT AND IN VITRO EVALUATION OF THEIR IMMUNOTOXICITY.

Abstract

O vírus da Hepatite B (HBV) é um vírus de DNA com envelope associado à família Hepadnaviridae, o qual é altamente hepatotrófico e espécie-específico, ou seja, replica-se exclusivamente em hepatócitos humanos. A infeção por HBV pode ocorrer no início da vida, o que geralmente leva a uma infeção crónica, caso não seja tratada corretamente. Caso a infeção por HBV ocorra mais tarde, geralmente resulta numa infeção aguda que tem a capacidade de se auto-resolver. Atualmente, para prevenir a infeção pelo HBV existe uma vacina injectável profilática, que consiste em 3 ou 4 doses (dependendo da região geográfica do indivíduo) contendo o antigénio de superfície do HBV (HBsAg) combinado com sais de alumínio. Apesar da vacina disponível ser eficaz, a prevalência do HBV ainda é um sério problema de saúde pública, razão pela qual eliminar a hepatite é uma das principais metas inscrita na Agenda 2030 das Nações Unidas. Embora o futuro pareça promissor, existem dois problemas que constituem uma ameaça à erradicação do HBV, sendo o primeiro a necessidade de melhorar a vacinação nos países em desenvolvimento e o segundo a inexistência de uma vacina terapêutica para uso em doentes crónicos. Uma forma de tentar resolver estes problemas é o uso da nanotecnologia como ferramenta para o desenvolvimento de adjuvantes de vacinas, uma vez que esta permite “desenhar” as nanopartículas com diversas composições, tamanhos e propriedades de superfície. A inclusão do antigénio em nanopartículas ajuda a aumentar a estabilidade do antigénio, a imunogenicidade e permite a entrega direcionada deste mesmo antigénio a células apresentadoras de antigénio. A delta inulina (denominada Advax ™) um polissacarídeo composto por unidades de frutose, tem vindo a ser testada em ensaios clínicos para uso na vacina contra o HBV. Uma das qualidades mais importantes da inulina, observada em estudos com animais, foi o aumento da resposta imune adaptativa, confirmada numa ampla variedade de antigénios virais e bacterianos, como influenza, encefalite japonesa, HIV, entre outros. Por conseguinte, esta dissertação de mestrado tem como objetivo desenvolver e produzir partículas de inulina combinadas ou não, com um polímero previamente estudado, como a Policaprolactona (PCL) ou Quitosano, para ser usado como adjuvante em vacinas. O método de produção desenvolvido e otimizado foi baseado em técnicas de nano-precipitação e as partículas foram caracterizadas quanto às suas características físico-químicas e imunotoxicológicas. Neste contexto três sistemas de entrega foram desenvolvidos: partículas de inulina, partículas de PCL-inulina e partículas de PCL. Enquanto as partículas de PCL-inulina e PCL apresentaram tamanhos médios de 301,26 nm e 275,32 nm respetivamente, as partículas de inulina eram muito maiores, encontravam-se fora da nano-escala (1320,86 nm). Os resultados das determinações de tamanho permitiram-nos inferir que as partículas são estáveis por 42 dias, com exceção das partículas de inulina que apresentaram uma tendência para aumento de tamanho ao longo do tempo. Em termos de imunotoxicidade, as partículas de inulina e PCL-inulina não mostraram toxicidade em culturas de células primárias do baço de murganho, embora na linha celular RAW 264,7 os resultados tenham sido ligeiramente diferentes, uma vez que as partículas de PCL-inulina mostraram alguma toxicidade em concentrações mais elevadas, o que foi também observado nas partículas PCL. Considerando os estudos de avaliação de produção de óxido nítrico (NO) e citocinas, as partículas não induziram a produção de NO quando incubadas com a linha celular RAW 264,7, nem a produção de GM-CSF. O mesmo foi verificado para o TNF-α, IL-6, IL-10, e IL-12 após incubação das partículas de PCL-inulina a 2 μg/mL com as DCs, onde se observou que não foram induzidos níveis significativos de citocinas. No entanto, a 4 μg/mL pode ver-se uma pequena indução da IL-12 e IL-10. No geral, relatamos o desenvolvimento e produção de partículas de inulina e policaprolactona, cujos resultados preliminares de diversos ensaios in vitro sugerem que são adequados para uso, como sistemas de entrega de antigénios, sem toxicidade esperada associada. No entanto, são necessários mais estudos para confirmar os resultados obtidos para a produção de citocinas com DCs, uma vez que a variabilidade entre dadores foi significativa. Por fim, estudos in vivo em murganhos usando o antigénio do HBV com as partículas de inulina e PCL-Inulina desenvolvidas, deverão elucidar-nos em futuras experiências sobre a real capacidade das formulações como estratégia para desenvolver novas vacinas e melhorar a vacinação contra o HBV.

Hepatitis B virus (HBV) is an enveloped DNA virus associated with the Hepadnaviridae family, being highly hepatotrophic and species-specific, meaning that HBV replicates exclusively in human hepatocytes. HBV infection can occur early in life, generally leading to chronic infection if not treated correctly. If HBV infection occurs later, an acute self-resolving infection might take place. To prevent HBV infection, there is currently a prophylactic vaccine, that consists in 3 or 4 doses (depending on the individual geographic region) of the injectable HBV surface antigen (HBsAg) adjuvanted with aluminum salts. Despite the effective vaccine available, HBV prevalence is still a serious global health problem, thus, eliminating hepatitis is a major goal in the United Nations 2030 Agenda. Although the future looks prospective, two main problems constitute a threat to the eradication of HBV, with the first problem being the need to improve vaccination in developing countries, and the second the non-existence of a therapeutic vaccine to be used in chronic patients. A way of trying to solve these problems is the use of nanotechnology to design vaccine adjuvants, since it allows to obtain nanoparticles with different compositions, sizes, and surface properties, which help to increase antigen stability, immunogenicity, and allow targeted delivery. Delta inulin isoform (called Advax ™) is a polysaccharide comprised of fructose units, that has been tested in clinical trials with the HBV vaccine. One of the important qualities of inulin shown in animal studies, was the enhancement in the adaptive immune response, which was confirmed against a wide variety of viral and bacterial antigens, like influenza, Japanese encephalitis, HIV, and others. Therefore, this master dissertation aims to develop and produce Inulin particles blended or not with other polymers, previously studied for vaccine adjuvant purposes, such as Polycaprolactone (PCL) or Chitosan. The production method developed and optimized was based on nanoprecipitation techniques and the particles were characterized regarding their physicochemical and immune-toxicological characteristics. Three main delivery systems were developed: inulin particles, PCL-inulin particles and PCL particles. While PCL-inulin and PCL particles had sizes of 301.26 nm and 275.32 nm respectively, inulin particles, were much bigger, and out of the nanoscale (1320.86 nm). The size measurement results allowed us to infer that the particles were stable for 42 days, with the exception of Inulin based particles that present a tendency to increase their size. In terms of immunotoxicity, Inulin and PCL-Inulin particles have shown no toxicity in primary murine spleen cells, although in RAW 264.7 cell line, the results were a little different, as PCL-Inulin particles have shown some toxicity in higher concentrations, which was the same observed in PCL particles. Considering the nitric oxide (NO) and cytokine production studies, the particles did not induce NO production when incubated with RAW 264.7 cell line nor GM-CSF production. Considering the TNF-α, IL-6, IL-10, and IL-12 production by DCs incubated with different particles, the results revealed that the PCL-Inulin at 2 µg/mL does not induce the production of significant cytokine levels. However, at 4 µg/mL concentration, we observed a small induction of the production of the IL-12 and IL-10. Overall, we reported a successful development and production of Inulin particles blended with Polycaprolactone polymer, which preliminary results suggest that they are suitable for use as antigen delivery systems, with no expectable toxicity associated. However further studies are required to confirm the results obtained for cytokine production with DCs since donor variability was significant. Ultimately, in vivo studies in mice using HBV antigens with the developed Inulin and PCL-Inulin particles, should elucidate about the real ability of these formulations as a strategy to improve HBV vaccination.