NON-PATHOGENIC VIRAL VECTORS PSEUDOTYPED WITH THE SARS-COV-2 S PROTEIN TO STUDY DRUG REPURPOSING AND IMMUNIZATION STRATEGIES

Abstract

O coronavírus da síndrome respiratória aguda grave 2 (SARS-CoV-2) é o vírus responsável pela doença coronavírus 2019 (COVID-19). Os primeiros casos de SARS-CoV-2 foram reportados na China e, em setembro de 2021, mais de 228 milhões de pessoas foram infectadas e mais de 4 milhões de mortes foram registadas por esta doença. Embora a origem do SARS-CoV-2 ainda seja desconhecida, a explicação mais aceite é um evento zoonótico. O SARS-CoV-2 pertence à família Coronaviridae (ordem Nidovirales), um grupo de vírus de (+) RNA de cadeia única, com envelopes que podem infectar três classes principais de vertebrados: mamíferos, pássaros e peixes. Todos os membros desta família compartilham um grupo de características, tais como a presença de uma nucleocápside (N) de múltiplas cópias de uma fosfoproteína, a proteína de membrana integral (M) e a proteína N-glicosilada spike (S). O principal mecanismo de infecção celular do SARS-CoV-2 baseia-se na afinidade da proteína S pelo receptor celular da enzima conversora de angiotensina 2 (ACE2).No presente trabalho foram investigados 1970 fármacos aprovados pela FDA pela sua capacidade de inibir ou potenciar a infecção de células HEK-293T, expressando o receptor celular ACE2 humano, por vectores lentivirais pseudotipados de forma a exibir a proteína S do SARS-CoV-2 à sua superfície e codificando a proteína luciferase. O tratamento foi adicionado às células concomitante com os vetores lentivirais pseudotipados, e posteriormente, a capacidade de infecção foi quantificada pela intensidade de luminescência emitida pelas células.Também foi avaliada a capacidade de imunização desta partícula em murganhos C57BL/6, para tal, vetores lentivirais pseudotipados com a proteínas S foram administrados em murganhos fêmeas por via intraperitoneal e um reforço adicional por via intranasal.Além disso, empregamos as mesmas partículas lentivirais pseudotipadas de proteína S para estudar sua capacidade de imunização em camundongos C57BL/6 para esse fim, LVP foi administrado a camundongos fêmeas por via intraperitoneal e reforço adicional por via intranasal.Foram identificados 66 fármacos que inibiram a infecção da partícula pseudotipada, sendo 33 deles relatados pela primeira vez neste trabalho e 59 fármacos que mostraram um aumento da infecção nas células testadas. No total, 124 fármacos estão a ser avaliados por curvas dose-resposta sendo que dos 25 fármacos já avaliados, apenas oito apresentaram correlação dose-resposta.Além disso, a estratégia de imunização aqui desenvolvida com a partícula pseudotipada induziu a produção de anticorpos IgG contra a proteína spike nos murganhos imunizados. A análise do soro destes animais também revelou a capacidade de inibir a infecção da partícula pseudotipada em células HEK-hACE2, demonstrando a viabilidade e eficácia dos anticorpos IgG produzidos. Por fim, estes resultados contribuem para a geração de novas estratégias de tratamento e imunização para a COVID-19 e evidenciam a necessidade de continuar este estudo para compreender as novas descobertas aqui apresentadas.

Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is the virus responsible for the coronavirus disease 2019 (COVID-19). SARS-CoV-2 outbreak began in China, and as of September of 2021, more than 228 million people have been infected and more than 4 million deaths were registered. Although the origin of SARS-CoV-2 is still unknown, the most parsimonious explanation is a zoonotic event. SARS-CoV-2 belongs to the Coronaviridae family (order Nidovirales), a group of enveloped and positive single-strand RNA viruses that can infect three major classes of vertebrates: mammals, birds, and fish. All members of this family share a group of characteristics such as the presence of a nucleocapsid (N) of multiple copies of a phosphoprotein, the integral membrane protein (M) and the N-glycosylated spike protein (S). The major cell infection mechanism of SARS-CoV-2 is based on the affinity of the S protein by the cell receptor angiotensin- converting enzyme- 2 (ACE2).In the present work, we investigated the capacity of a library of 1970 FDA-approved drugs to inhibit or potentiate infection of HEK-293T cells overexpressing the human ACE2 cellular receptor by a pseudotyped lentiviral particle exhibiting the S protein of SARS-CoV-2 at its surface and encoding luciferase. The drug treatment and pseudotyped particles were added to the cells at the same time and after an incubation period, the infection capacity was measured as luminescence emission by the cells.Furthermore, we employed the same S-protein pseudotyped lentiviral particles to study its immunization capacity in C57BL/6 mice for that purpose, LVP were administered to female mice via intraperitoneal route and further boost through intranasal route.We have identified 66 drugs that inhibit infection of the pseudotyped LVP, being 33 drugs first reported in this work. Furthermore, we also identified 59 drugs that potentiated SARS-CoV-2 pseudotyped LVP infection. Dose-response curves of the identified compounds are still being analyzed and from the 25 drugs already evaluated, eight showed a dose-response correlation.Finally, the immunization strategy here developed with the LVP-Spike induced the production of IgG antibodies against S protein in the immunized mice. The analysis of immunized animal serum also showed the capacity to inhibit the infection of the LVP-Spike in HEK-hACE2 cells, demonstrating the viability and efficacy of the produced IgG antibodies. In conclusion, these results contribute to the generation of new strategies for COVID-19 treatment and immunization, and evidence the need for continuation of this study to better explore and develop the new finds here presented.