Plasma Frio Atmosférico como Abordagem Terapêutica no Carcinoma Hepatocelular

Abstract

The Hepatocellular carcinoma is the seventh most common type of cancer and the fourth with the highest mortality worldwide. The high mortality rate of this primary liver neoplasm is due to the fact that it is an asymptomatic disease in its early stages, being thus diagnosed in later stages where the application of therapeutic strategies is very limited. Furthermore, the therapies available in clinical practice frequently do not have the desired efficacy and are associated with a large number of adverse effects. Therefore, studies have shown that atmospheric cold plasma can be used as an innovative treatment for various types of cancer.Atmospheric cold plasma (AFP), also known as the fourth physical state of matter, is a partially ionized gas, that due to being produced at a temperature below 40ºC can be applied to biological tissues without the risk of inducing damage. Furthermore, it has demonstrated the ability to decrease cell proliferation of tumour cells without inducing any type of damage to normal cells. Nevertheless, its mechanism of action is not known. Studies indicate that the anti-tumour effect of atmospheric cold plasma may be related to the production of reactive species during electrical discharge, however, physical factors such as UV radiation, electromagnetic fields and charged particles should not be disregarded.The main objective of this dissertation was to evaluate the therapeutic potential of atmospheric cold plasma in hepatocellular carcinoma.For this purpose, an electronic device capable of generating a high voltage discharge, developed at the Biophysics Institute of the Faculty of Medicine of the University of Coimbra, was used to produce Atmospheric Cold Plasma. Additionally, three representative hepatocellular carcinoma cell lines with different P53 protein expression profiles were used: HuH7, HepG2 and Hep3B. To determine the cytotoxicity of the PFA treatment, the cells were subjected to short exposure periods (15, 30, 60, 90 and 120 seconds). Metabolic activity and protein content were evaluated 24, 48 and 72h after the treatment. The subsequent assays, referring to the viability and cell death profile, cell cycle and mitochondrial membrane potential, were carried out 48h after exposure to the PFA, for exposure times of 15, 60 and 120s. The same procedure was applied to evaluate the reactive oxygen species.After treatment with PFA, it was possible to verify a decrease in cell proliferation in the three cell lines under study, which was dependent on the time of exposure and incubation to the therapy, even so, the HuH7 line showed greater sensitivity to the treatment. It was also observed, for all cell lines, a decrease in cell viability accompanied by an increase in cell death due to apoptosis and necrosis, with necrosis being the most prevalent type of death for longer exposure times to therapy. Additionally, there was a blockage of the cell cycle in the G2/M phase, which is indicative of a loss of replication capacity. In addition to the aforementioned effects, atmospheric cold plasma therapy also induced mitochondrial membrane depolarization for the longest exposure time in all cell lines, being more evident in the Hep3B line. Regarding to reactive oxygen species, it was possible to observe a decrease in the intracellular content of peroxides for all cell lines under study. An increase in the intracellular concentration of superoxide radicals was also observed for the HepG2 and Hep3B lines, mainly 2h after treatment, indicating that this species may have an influence on the mechanism of action of atmospheric cold plasma.The results obtained demonstrate that, in fact, atmospheric cold plasma induces an anti-proliferative effect on hepatocellular carcinoma cell lines. Nonetheless, the need for a greater number of studies, especially in more complex models, is necessary in order to allow a closer approach to clinical practice.

O carcinoma hepatocelular é o sétimo tipo de cancro mais incidente e o quarto com maior mortalidade em todo o mundo. A elevada taxa de mortalidade desta neoplasia primária do fígado deve-se ao facto de esta ser assintomática em estágios iniciais da doença, sendo assim diagnosticada em fases tardias onde a aplicação de estratégias terapêuticas é muito reduzida. Para além disso, as terapias disponíveis na prática clínica por vezes não têm a eficácia desejada e estão associadas a um grande número de efeitos adversos. Neste sentido, estudos têm demonstrado o plasma frio atmosférico como um tratamento inovador para vários tipos de cancro. O plasma frio atmosférico (PFA), também conhecido pelo quarto estado físico da matéria, é um gás parcialmente ionizado, produzido a uma temperatura inferior a 40ºC, e, portanto, pode ser aplicado em tecidos biológicos sem riscos de induzir lesão. Para além disso, tem demonstrado a capacidade de diminuir a proliferação celular de células tumorais sem induzir qualquer tipo de danos em células normais. Ainda assim, o seu mecanismo de ação não é conhecido. Estudos indicam que o efeito anti tumoral do plasma frio atmosférico possa estar relacionado com a produção de espécies reativas durante a descarga elétrica, no entanto, fatores físicos como radiação UV, campos eletromagnéticos e partículas carregadas não devem ser desconsiderados. O principal objetivo desta dissertação foi, assim, avaliar o potencial terapêutico do plasma frio atmosférico no carcinoma hepatocelular.Com essa finalidade, foi utilizado um dispositivo eletrónico capaz de gerar uma descarga de alta tensão para produzir Plasma Frio Atmosférico, desenvolvido no Instituto de Biofísica da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra. Adicionalmente, foram utilizadas três linhas celulares representativas de carcinoma hepatocelular com diferentes perfis de expressão da proteína P53: HuH7, HepG2 e Hep3B. Para determinar a citotoxicidade do tratamento com PFA, as células foram submetidas a curtos períodos de exposição (15, 30, 60, 90 e 120 segundos). A atividade metabólica e o conteúdo proteico foram avaliados 24, 48 e 72h após o tratamento. Os ensaios subsequentes, referentes à viabilidade e perfil de morte celular, ciclo celular e potencial de membrana mitocondrial, foram realizados 48h após exposição ao PFA, para os tempos de exposição de 15, 60 e 120s. O mesmo se procedeu para os ensaios de avaliação das espécies reativas de oxigénio. Após o tratamento com PFA, foi possivel verificar uma diminuição da proliferação celular nas três linhas celulares em estudo, de uma forma dependente do tempo de exposição e incubação à terapia, ainda assim, a linha HuH7 demonstrou uma maior sensibilidade ao tratamento. Foi também observado, para todas as linhas celulares, uma diminuição da viabilidade celular acompanhada por um aumento de morte celular por apoptose e necrose, sendo a necrose o tipo de morte mais predominante para os maiores tempos de exposição à terapia. Adicionalmente, foi verificado um bloqueio do ciclo celular na fase G2/M, indicativo de perda da capacidade de replicação. Para além dos efeitos anteriormente referidos, a terapia com plasma frio atmosférico induziu ainda despolarização da membrana mitocondrial para o maior tempo de exposição, em todas as linhas celulares, sendo mais evidente na linha Hep3B. No que diz respeito às espécies reativas de oxigénio, foi possivel observar uma diminuição do conteúdo intracelular de peróxidos para todas as linhas celulares em estudo. Foi também observado um aumento da concentração intracelular de radical superóxido para as linhas HepG2 e Hep3B, principalmente 2h após o tratamento, indicando que esta espécie pode ter influência no mecanismo de ação do plasma frio atmosférico.Os resultados obtidos demonstram que, de facto, o plasma frio atmosférico induz um efeito anti proliferativo em linhas celulares de carcinoma hepatocelular. Ainda assim, é de reforçar a necessidade de um maior número de estudos, principalmente em modelos mais complexos, de maneira a permitir uma abordagem mais próxima da prática clínica.