DETEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE ISOLADOS DE ENTEROBACTÉRIAS RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS EM PRODUTOS FRESCOS PRONTOS A CONSUMIR

Abstract

A resistência antimicrobiana é atualmente uma das maiores ameaças à saúde pública, particularmente as Enterobactérias multirresistentes aos antibióticos. Os genes de resistência aos antibióticos (GRA) podem passar através da cadeia alimentar para a microbiota humana ou para bactérias potencialmente patogénicas. Os produtos frescos prontos a consumir representam um risco acrescido na disseminação de GRAs, uma vez que estes alimentos são consumidos sem nenhum processamento adicional. O objetivo deste estudo visa compreender se os produtos frescos prontos a consumir, representam um importante veículo de transmissão de bactérias Gram-negativo resistentes aos antibióticos para os seres humanos. Quarenta e duas amostras de diversos alimentos prontos a consumir, como saladas preparadas de frutas e vegetais, foram adquiridas em supermercados portugueses e processadas com e sem enriquecimento. As bactérias foram isoladas em gelose MacConkey com cefotaxima (CTX; 1 µg/mL) e colistina (COL; 2 µg/mL). O perfil de suscetibilidade antimicrobiana para seis antibióticos beta-lactâmicos foi determinado pelo método de difusão em disco e para COL pelo método de microdiluição em caldo. Das bactérias isoladas, foram selecionadas as que apresentaram uma ou mais resistência aos antibióticos, e /ou exposição aumentada a algum destes, para posteriormente se realizar a amplificação parcial do 16S rARN por reação em cadeia da polimerase. Dessas, 25 foram selecionadas para identificação molecular por sequenciação pelo método de Sanger; as sequências foram analisadas no Sequencher 5.0 (Gene Codes) e identificadas através do BLAST e GenBank. Através da seleção com CTX, foram identificadas maioritariamente espécies de Enterobactérias ambientais, como Rahnella spp., com reduzida suscetibilidade a CTX, Citrobacter portucalensis, resistente à cefoxitina e amoxicilina/ácido clavulânico (FOX, AMC), e Klebsiella oxytoca, com resistência a AMC, CTX, FOX e aztreonam (AZT). Pela seleção com COL, identificou-se um isolado de Yersinia enterocolitica, suscetível a todos os antibióticos em estudo. As espécies de Rahnella spp. e Serratia spp., também foram identificadas através desta seleção, apresentando resistência à COL. Neste estudo, não se verificou a presença das Enterobactérias Escherichia coli e Klebsiella pneumoniae nas amostras. Porém foi identificada uma bactéria patogénica oportunista, Klebsiella oxytoca, e ainda um isolado de Yersinia enterocolitica responsável por gastroenterites graves no ser humano, embora não se tenha verificado se correspondia ao serótipo patogénico. Os resultados obtidos demonstram a importância da avaliação microbiológica dos produtos frescos prontos a consumir, assim como necessidade da realização de mais estudos para estes alimentos, de modo a colmatar dúvidas e lacunas existentes sobre tema, tais como, a minimização de contaminação cruzada ao longo da cadeia alimentar, e perceber se existem outros parâmetros de avaliação microbiológica que devem ser reavaliados ou inseridos na legislação.

Antimicrobial resistance is one of the current public health threats, particularly multidrug resistant Enterobacteriaceae. Antibiotic resistance genes (ARGs) may pass through the food chain to the human microbiome or to human pathogens. Ready to eat (RTE) vegetables represent an increased risk in the dissemination of ARGs, as the food is consumed without further manipulation. The aim of this study was to understand if RTE foods represent an important vehicle for the transmission of antibiotic-resistant bacteria to humans. Forty-two RTE fresh products samples were acquired from Portuguese supermarkets and processed with and without enrichment. The bacteria were isolated in MacConkey agar with cefotaxime (CTX; 1 µg/mL) or colistin (COL; 2 µg/mL). The antimicrobial susceptibility profile for six β-lactam antibiotics was determined by disk diffusion and for COL by broth microdilution. Selected isolates, with one or more antibiotic resistance and/or increased exposure, were identified by 16S rARN amplification by polymerase chain reaction and Sanger sequencing; sequences were analysed in Sequencher 5.0 (Gene Codes) and identified with BLAST and GenBank. The results under CTX selection showed the prevalence of environmental Enterobacteriaceae, such as Rahnella spp. that showed reduced susceptibility to CTX, Citrobacter portucalensis resistant to cefoxitin (FOX) and amoxicillin/clavulanic acid (AMC), and Klebsiella oxytoca, which was resistant to AMC, CTX, FOX and aztreonam (AZT). Under COL selection we identified one Yersinia enterocolitica, susceptible to all antibiotics in this study. Rahnella and Serratia species were also identified, and showed resistance to COL. In this study, the presence of Enterobacteriaceae, Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae was not found in the samples. However, an opportunistic pathogenic bacterium, Klebsiella oxytoca, was identified, as well as an isolate of Yersinia enterocolitica, responsible for severe gastroenteritis in humans, though it was not verified if it corresponded to the pathogenic serotype. The results obtained demonstrate the importance of the microbiological assessment of ready-to-eat fresh produce, as well as the need for further studies to be carried out on these foods, to resolve doubts and gaps that exist on this subject, such as minimising crosscontamination along the food chain, and to understand whether there are other microbiological assessment parameters that should be reassessed or included in the legislation.