The Role of Sp1 in Oligodendrocyte differentiation: a mechanically-regulated transcription factor

Abstract

Oligodendrócitos são as células da glia do sistema nervoso central (CNS) responsáveis pela produção das bainhas de mielina. Estas estruturas permitem a insolação dos neurónios, melhorando a transmissão dos impulsos elétricos. Danos nas bainhas de mielina, acompanhados por uma incorreta diferenciação dos oligodendrócitos, são a base de um grupo de patologias conhecidas como doenças desmielinizantes. Estas são caraterizadas por uma transmissão anormal do impulso nervoso, o que leva a sintomas como convulsões e paralisia. Este é o caso da esclerose múltipla (MS), onde falhas na diferenciação de oligodendrócitos e na remielinização culminam na morte de células neurais. A MS é a doença desmielinizante mais comum no planeta, afetando mais de 2.3 milhões de pessoas no mundo. Estudos recentres identificaram alterações nas propriedades biofísicas da matriz extracelular (ECM) do CNS de pacientes com MS, o que sugere que a rigidez da ECM possa ser importante na fisiopatologia desta doença. Em contraste, outras doenças desmielinizantes, como a distrofia muscular congénita tipo 1A (MDC1A), originam de uma falta de merosina (MN) na ECM, a qual é uma proteína que promove a diferenciação de oligodendrócitos. A rigidez da ECM tem sido extensivamente estudada como uma forma de modular mecanicamente a diferenciação e as funções celulares. Em oligodendrócitos de rato, a diferenciação é otimizada quando as células são diferenciadas em substratos compatíveis com a rigidez do cérebro de 6.5 kPa. Isto levou a um aumento da expressão da proteína básica da mielina (MBP) e este efeito foi acentuado pela presença de MN. Resultados não publicados do nosso laboratório relacionam o aumento da expressão de MBP com a translocação nuclear da proteína de especificidade 1 (Sp1), de uma forma dependente da rigidez do substrato. O Sp1 já está descrito como um promotor da síntese de MBP. No entanto, esta foi a primeira vez que este processo foi descrito em resposta a um estímulo mecânico. Recorrendo a géis de poliacrilamida (PAHs) com diferentes graus de rigidez como substratos para cultura celular, nós propusemo-nos a investigar o mecanismo por detrás da ativação do Sp1 em condições compatíveis com o cérebro. Para tal, avaliámos se a transdução de sinal dependia de integrinas, funcionalizando os géis com poli-d-lisina (PDL) ou uma combinação de PDL/MN. Ademais, a fosforilação do Sp1pela ERK foi estudada como uma possível forma de regulação da atividade do Sp1. Por fim, desafiámo-nos a revelar possíveis alvos do Sp1 para além da transcrição de MBP. O nosso interesse foi focado em determinar se o Sp1 conseguia promover a saída do ciclo celular durante a diferenciação de oligodendrócitos. Os nossos resultados revelaram que a mecanotransdução acionada pela rigidez extracelular que leva à translocação nuclear do Sp1 é independente da ativação de integrinas. Além disso, a fosforilação do Sp1 não está relacionada com a sua translocação nuclear. Contudo, a ERK foi capaz de regular a atividade do Sp1 indiretamente, evidenciando a existência de moléculas intermediárias que faltam identificar nesta via. A atividade do Sp1 não levou a um aumento de p21, todavia, substratos menos rígidos promoveram a síntese desta proteína, o que sugere que estas rigidezes favorecem a saída do ciclo celular em oligodendrócitos em diferenciação. Tomados em conjunto, estes resultados elucidam uma nova via que pode melhorar a diferenciação de oligodendrócitos. A aquisição de mais conhecimentos sobre a mecano-modulação da síntese de MBP mediada pelo Sp1 em resposta às propriedades biofísicas do ambiente extracelular pode levar à descoberta de um novo alvo terapêutica que promova a diferenciação de oligodendrócitos em doenças desmielinizantes.

Oligodendrocytes are the glial cells from the central nervous system (CNS) responsible for the production of myelin sheaths. These structures allow for neuron insolation, improving the transmission of electric impulses. Damages in myelin sheaths accompanied by defective oligodendrocyte differentiation are the foundation of a group of diseases known as demyelinating disorders. These disorders are characterized by abnormal nervous impulse transmission, which leads to symptoms such as convulsions and paralysis. This is the case of multiple sclerosis (MS) where failed oligodendrocyte differentiation and remyelination culminate in neuronal cell death. MS is the most common demyelinating disease in the world, affecting over 2.3 million people worldwide. Recent studies identified changes in the biophysical properties of the extracellular matrix (ECM) of the CNS in MS patients, which suggests that ECM stiffness may be important in the pathophysiology of this disease. In contrast, other demyelinating disorders, such as congenital muscle dystrophy type 1A (MDC1A) result from a lack of merosin (MN) in the ECM, which is a protein that promotes oligodendrocyte differentiation. ECM stiffness has been extensively studied as a way to mechanically-modulate cell fate and function. In rat oligodendrocytes, differentiation is optimized when cells are differentiated in brain-complaint substrates of 6.5 kPa. This resulted in an increased expression of the myelin basic protein (MBP). This effect was further accentuated by the presence of MN. Unpublished data from our lab correlated the increased MBP expression with the nuclear translocation of the specificity protein 1 (Sp1), in a substrate stiffness dependent manner. Sp1 has been known to promote MBP synthesis, however this is the first time this process was described as a response to mechanical stimuli. Using poly-acrylamide hydrogels (PAHs) of varying stiffnesses as substrates for cell culture, we set out to investigate the mechanism behind Sp1 activation in brain-complaint conditions. To accomplish this, we assessed if the signal transduction was integrin-dependent, by functionalizing the substrates with poly-d-lysine (PDL) or a combination of PDL/MN. Furthermore, Sp1 phosphorylation via ERK was studied as a possible regulator of Sp1 activity. Finally, we set out to uncover possible downstream targets of Sp1 besides MBP. We were mainly interested in determining if Sp1 could promote cell cycle exit during oligodendrocyte differentiation. Our results revealed that the mechanotransduction triggered by extracellular stiffness that leads to Sp1’s nuclear translocation is integrin-independent. Moreover, the phosphorylation of Sp1 did not correlate with its nuclear translocation. However, ERK was able to regulate Sp1 activity indirectly, evidencing the presence of intermediary unidentified molecules in this pathway. Sp1’s activity did not lead to an increase in p21, however, soft substrates promoted the synthesis of this protein, suggesting that these stiffnesses favor cell cycle arrest of differentiating oligodendrocytes. Taken together, these results shed light on a new uncharacterized pathway that can improve oligodendrocyte differentiation. Further understanding on how the biophysical properties of the extracellular environment can modulate Sp1-mediated MBP synthesis could uncover a new therapeutic target to promote oligodendrocyte differentiation in demyelinating disorders.