Unraveling the interplay between fibroblasts and osteosarcoma cells during lung metastasis formation

Abstract

Introdução: O osteossarcoma (OS) é um tumor primário maligno que usualmente metastiza para o pulmão. Evidências crescentes sugerem que o tumor primário promove alterações fenotípicas nos fibroblastos pulmonares residentes, formando um nicho pré-metastático que favorece a colonização e desenvolvimento de metástases pulmonares. Posto isto, avaliámos a modulação do microambiente pulmonar e os efeitos recíprocos dos fibroblastos ativados sobre as células tumorais antes da colonização do pulmão. Materiais e métodos: Os pulmões foram recolhidos de murganhos não tratados, tratados com o secretoma das células 143B e de murganhos que possuíam um tumor primário subcutâneo. A modulação das proteínas da matriz extracelular (ECM), colagénio I/III e fibronectina foram avaliadas por imunohistoquímica e por western blot. Os fibroblastos pulmonares foram isolados a partir das três diferentes condições e avaliada a expressão de marcadores de ativação (α-SMA, vimentina e fibronectina) por imunocitoquímica e western blot. A capacidade de migração dos fibroblastos pulmonares também foi avaliada por um ensaio de scratch. A expressão de citocinas inflamatórias foi avaliada por qRT-PCR tanto no tecido como nos fibroblastos pulmonares. Depois desta caracterização, as células 143B foram expostas ao secretoma dos fibroblastos normais (NFs), e dos fibroblastos ativados derivados de murganhos tratados com o secretoma das células 143B (NAFsSCR) e derivados de animais com um tumor primário (NAFsSCT) em diferentes tempos de incubação. A quimiosensibilidade destas células à doxorubicina foi avaliada utilizando um ensaio colorimétrico com resazurina, assim como, características estaminais analisadas por um ensaio de formação de esferas e a expressão de genes de pluripotência e genes alvo da via de sinalização Wnt por qRT-PCR. A indução do estado de dormência foi avaliada por western blot. A adesão das células tumorais à fibronectina foi analisada na presença e na ausência de um anticorpo neutralizador da integrina β1. Resultados: O tecido pulmonar recolhido dos dois modelos animais tratados mostrou um aumento na deposição de fibras de reticulina (colagénio I/III) e fibronectina, e os fibroblastos pulmonares expressaram α-SMA, vimentina e fibronectina, bem como, um aumento significativo de mediadores inflamatórios, sugerindo um estado de ativação. As células 143B tornaram-se mais resistentes à doxorubicina, após serem expostas ao secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT, e adquirem propriedades estaminais, nomeadamente uma elevada expressão de SOX2 e KLF4, bem como, um aumento na eficiência de formação de esferas e no seu diâmetro. Às 24h de incubação, as células 143B entraram num estado de dormência, mostrado pela elevada expressão de p-p38 e diminuta expressão da pERK, representado por um rácio que muda progressivamente para o seu inverso, promovendo um fenótipo proliferativo. O secretoma das NAFsSCR e NAFsSCT também estimula a adesão das células tumorais à fibronectina, sendo esta ligação mediada pela integrina β1. Conclusões: As células 143B, através da secreção de biomoléculas, induzem alterações no parênquima pulmonar e promovem a ativação dos fibroblastos, que têm efeitos recíprocos nas células tumorais, favorecendo a sua resistência à quimioterapia, entrada num estado de dormência antes de iniciarem a sua proliferação e aumentam as suas propriedades de adesão. Estes resultados evidenciam a interação mútua entre os fibroblastos e as células tumorais antes do início da colonização do pulmão. Adicionalmente, alguns destes mecanismos mediados pelos fibroblastos podem representar potenciais alvos para prevenir a formação de metástases pulmonares.

Introduction: Osteosarcoma (OS) is a primary bone tumor that frequently metastasized to the lung. Growing evidence suggests that primary tumors evoke phenotypic changes in resident lung fibroblasts, forming a supportive pre-metastatic niche (PMN) that favors the colonization and development of lung metastasis. Herein, we evaluated the modulation of the lung microenvironment and the reciprocal effects of reactive fibroblasts over tumor cells before lung colonization. Material and Methods: Mice lungs were harvested from untreated animals, treated with the secretome from 143B OS cells, and mice bearing a subcutaneous primary tumor. The modulation of the extracellular matrix (ECM) proteins, collagen I/III and fibronectin were evaluated by immunohistochemistry and western blot. Lung fibroblasts were then isolated from the three different conditions and assayed for the expression of activation markers (α-SMA, vimentin, and fibronectin) by immunofluorescence and western blot. The migratory capacity of lung fibroblasts was also evaluated through a scratch assay. Inflammatory cytokines expression was also evaluated by qRT-PCR in lung tissue and lung fibroblasts. Afterward, the 143B cells were then exposed to the secretome of normal (NFs), activated fibroblasts derived from mice treated with 143B cells secretome (NAFsSCR) and from mice bearing a subcutaneous tumor (NAFsSCT) for different time points. These tumor cells were tested for the chemosensitivity to doxorubicin using a colorimetric resazurin assay andstemness-related features by a sphere-forming assay, and pluripotency genes and Wnt target genes expression by qRT-PCR. The induction of a dormancy state was assessed through western blot. OS cells adhesion to fibronectin was analyzed in the presence and absence of a neutralizing anti-integrin β1 antibody. Results: Lung tissue from both treated animal models displayed increased deposition of reticulin fibers (collagen I/III) and fibronectin, and lung fibroblasts expressed α-SMA, vimentin, and fibronectin, along with an increased up-regulation of inflammatory mediators suggesting an activated state. 143B OS cells became more resistant to doxorubicin after being exposed to the NAFsSCR and NAFsSCT-derived secretome and acquired stem-like cell features, namely increased expression of SOX2 and KLF4, and enhanced sphere-forming efficiency and diameter. At 24h, 143B cells entered into a dormancy-like state, as shown by a p38high/pERKlow ratio that progressively switched to a p38low/pERKhigh proliferative phenotype. The NAFsSCR and NAFsSCT-derived secretome also stimulated integrin-β1-mediated adhesion of 143B cells to fibronectin. Conclusions: OS 143B cells, through the release of biomolecules, induce alterations in the lung parenchyma and promote the activation of fibroblasts, which have reciprocal effects on tumor cells, favoring their ability to survive chemotherapy, exploit the dormancy state before engaging in a proliferative state and enhance their adhesion properties. These findings provide evidence of mutual interaction between fibroblasts and tumor cells before the onset of lung colonization. Furthermore, some of these fibroblast-mediated mechanisms provide potential targets to prevent lung metastasis formation.