The role of carbon monoxide on modulation of microglial phagocytosis as neuroninflammatory response

Abstract

As células da microglia são as principais células imunitárias do sistema nervoso central (SNC). Como tal, estão envolvidas na regulação da inflamação e da fagocitose. A fagocitose é um mecanismo crucial através do qual a microglia elimina células mortas, elementos patogénicos, agregados proteicos e restos celulares, mantendo assim a homeostase dentro do SNC. Duma forma simplista, a fagocitose pode ser dividida em quatro fases - Reconhecimento, Engulfment, Tráfico/Maturação e Degradação. Os mecanismos moleculares que regem a fagocitose microglial ainda estão pouco estudados, principalmente as três últimas fases. O monóxido de carbono (CO) é produzido intracelularmente e já foi demonstrado que é capaz de exercer efeitos sobre uma ampla gama de proteínas e modular diferentes vias relacionadas com a regulação da resposta imune, prevenção da apoptose e o processo fagocítico. Além disso, o nosso laboratório já demonstrou que CO regula funções cruciais da microglia como a comunicação microglia-neurónio, nomeadamente, via secretoma. No entanto, no contexto da fagocitose microglial, há muito por descobrir sobre a capacidade modulatória do CO.Assim, o principal objetivo desta tese foi explorar os efeitos do CO na fagocitose microglial. Ao longo deste trabalho, explorámos como o CO impacta o engulfment de partículas-alvos, o tráfico fagossomal e a degradação da carga fagocítica. Para o efeito, utilizámos a ALF826, uma nova molécula libertadora de CO, com molibdénio como centro metálico, desenvolvida pelo Dr. Carlos Romão da ITQB / Proterris.Primeiro, otimizámos o protocolo de fagocitose, incubando esferas fluorescentes de látex com células BV2, com ou sem tratamento de CO, em condições inflamatórias e não inflamatórias. Posteriormente, as amostras foram fixadas e analisadas por microscopia de fluorescência. Em condições inflamatórias, a administração de CO tendeu a reduzir o aumento da eficiência fagocítica promovido por LPS. Considerando a relevância biológica da fagocitose de neurónios, e usando o nosso protocolo de fagocitose, avaliámos o engulfment de neurónios apoptóticos, através da observação de células vivas ao microscópio e ensaios de citometria de fluxo. No primeiro caso, num contexto inflamatório, o tratamento com CO não produziu efeitos significativos. No entanto, quando analisado por citometria de fluxo, o CO, tanto em condições não inflamatórias como inflamatórias, promoveu o engulfment de detritos neuronais. Em seguida, a co-localização de proteínas LAMP-1 com detritos neuronais foi avaliada via microscopia confocal, como forma de avaliar o sucesso do tráfico de fagossomas para os lisossomas. O papel desempenhado pelo CO nesta fase é incerto, porém, os resultados revelaram que a sua administração influencia o tráfico de fagosomas. Usando DQ-BSA, uma proteína fluorescente self-quenched, avaliámos a capacidade degradativa dos fagolisossomas pela leitura da fluorescência resultante do DQ-BSA degradado e, portanto, unquenched. No geral, o CO promoveu a degradação da carga fagocítica, em condições não inflamatórias.Em suma, a administração de CO promove o engulfment de neurónios mortos por parte da microglia. Por forma a puder-se tirar conclusões mais definitivas e averiguar o impacto concreto do CO nas fases de tráfico e de degradação, é necessária a realização de mais experiências.

Microglia are the primary resident immune cells of the central nervous system (CNS). As such, they are involved in the modulation of inflammation and phagocytosis. Phagocytosis is a crucial mechanism through which microglia are able to clear dead cells, pathogens, protein aggregates and cellular debris, thus contributing to CNS’s homeostasis maintenance. From a simplistic view, phagocytosis can be divided into four stages – Recognition, Engulfment, Trafficking/Maturation and Degradation. The molecular mechanisms behind microglial phagocytosis are still poorly understood, especially the last three stages. Carbon monoxide (CO) is produced intracellularly and has been shown to exert effects on a wide range of proteins and modulating different pathways related to immune response regulation, apoptosis prevention and the phagocytic process. Furthermore, our lab as already disclosed that CO regulates crucial microglial functions related to microglia-neuron communication, in particular via secretome. However, in the context of microglial phagocytosis, there is much to uncover about CO’s modulation capability. Thus, the main goal of this thesis was to explore CO’s effects on microglial phagocytosis. Throughout this work we explored how CO impacts target engulfment, phagosomal trafficking and cargo degradation. We used the novel molybdenum-based CO-releasing molecules ALF826 developed by Dr. Carlos Romão from ITQB/Proterris.Firstly, we optimized the phagocytosis protocol by incubating fluorescent latex beads with BV2 cells, with or without CO treatment, under inflammatory and non-inflammatory conditions. Samples were later fixed and analysed through fluorescence microscopy. Under inflammatory conditions, CO administration tended to reduce the increase in phagocytic efficiency promoted by LPS. Considering the biological relevancy of microglial neuronal clearance and using our phagocytosis protocol, we assessed the engulfment of apoptotic neurons through live cell imaging and flow cytometry assays. In the former, application of CO did not produce significant effects under an inflammatory context. However, when analysed through flow cytometry, CO, under both non-inflammatory and inflammatory conditions, promoted neuronal debris engulfment by almost 1-fold in comparison to the controls. Subsequently, co-localization of LAMP-1 proteins with neuronal debris was assessed through confocal microscopy, as a means of evaluating the trafficking of phagosomes into lysosomes. The role played by CO at this stage is uncertain, however, the results revealed that its administration influences phagosomal trafficking. Using DQ-BSA, a self-quenched fluorescent protein, we evaluated the degradative capacity of phagolysosomes by reading the resulting fluorescence from degraded, and thus unquenched, DQ-BSA. Overall, CO promoted cargo degradation in non-inflammatory conditions. In summary, CO administration promotes neuronal debris engulfment by microglia. Further experiments are required so as to draw more definite conclusions and better define CO’s impact on the trafficking and degradation stages.