Time-gated fluorescence lifetime microscope with light-sheet illumination

Abstract

A microscopia de tempo de vida de fluorescência Time-Gated baseia-se no processo de decaimento de fluorescência e permite observar a distribuição espacial dos fluoróforos contidos na amostra através do seu tempo de vida. Os fotões emitidos pela amostra são adquiridos em sucessões de janelas temporais com atrasos relativos ao pulso de excitação, resultando numa curva de decaimento mono ou multi-exponencial de onde é possível retirar os tempos de vida de fluorescência. Esta técnica de microscopia constitui um método de imagiologia funcional do metabolismo biológico, baseado na fluorescência endógena dos cofactores metabólicos NAD(P)H e FAD.O trabalho desenvolvido consiste na implementação de um microscópio de tempo de vida de fluorescência Time-Gated com iluminação light-sheet a 440 nm para imagiologia de fluorescência entre os 520 e 570 nm, em tecidos biológicos espessos. Procedeu-se ainda, à avaliação da exatidão e precisão do algoritmo Rapid Lifetime Determination (RLD) para a determinação dos parâmetros do decaimento de fluorescência através de simulações computacionais.O sistema foi caracterizado através de testes dos parâmetros óticos e temporais. A resolução axial do sistema é da ordem dos 20 um. O parâmetro temporal corresponde à exatidão das medições de tempo de vida de fluorescência e depende da largura da gate utilizada para as aquisições. O erro relativo da estimativa dos tempos de vida encontra-se entre os 5 e 14%. Por fim, testou-se o sistema com córneas animais.Os parâmetros obtidos cumpriram os requisitos do sistema, exceto o seccionamento ótico que se excedeu em mais de 6 um. No entanto, o sistema implementado é funcional e permitiu avaliar a sua aplicação em imagiologia de amostras biológicas. O sistema necessita de ser otimizado de modo a reduzir a espessura da light-sheet e aumentar o seccionamento ótico para obter imagens com contraste adequado de tecidos espessos.A avaliação computacional do algoritmo RLD mostrou que este não é adequado para imagiologia metabólica baseada na razão dos fatores pre-exponenciais do decaimento do FAD. A exatidão desta razão é sempre pior que 20%, mesmo para contagens totais elevadas.

Time-Gated fluorescence lifetime microscopy is based on the fluorescence decay process and allows to observe the spatial distribution of the fluorophores contained in a sample through their lifetime. The emitted photons from the sample are acquired in successive temporal gates with delays relative to the excitation pulse, resulting in a mono or multiexponential decay curve used to determine the fluorescence lifetimes. This microscopy technique allows functional imaging of biological metabolism, based on the endogenous fluorescence of metabolic co-factors NAD(P)H and FAD.In this work, it was implemented a Time-Gated fluorescence lifetime microscope with light-sheet illumination at 440 nm for fluorescence imaging in the range between 520 and 570 nm, in thick biological tissues. Also, it was evaluated, through computational simulations, the accuracy and precision of the Rapid Lifetime Determination (RLD) algorithm to estimate the parameters of the fluorescence decay.The system was characterized through tests of optical and timing parameters. The axial resolution of the system is in the range of 20 um. The timing parameter corresponds to the accuracy of the measurements of fluorescence lifetime and depends on the gate width used for acquisitions. The relative error of the fluorescence lifetime estimation is in the range of 5 to 14%. The system was tested using animal corneas.The obtained parameters met the system requirements, except the optical sectioning that exceeds the value in more than 6 um. However, the implemented microscope works as expected and allows the evaluation of its application for imaging biological samples. The system needs to be improved to decrease the light-sheet thickness and increase the optical sectioning to obtain images of thick tissues with adequate contrast.The computational evaluation of the RLD algorithm showed that it is not suitable for metabolic imaging based on the ratio of the pre-exponential factors of the FAD decay. The accuracy of this ratio is always worse than 20%, even for high values of total counts.