Measuring the changes in Apis mellifera microbiome composition after pesticide exposure

Abstract

A abelha melífera, Apis mellifera, contém uma larga comunidade de bactérias no seu intestino, compreendendo cerca de 1 bilião de células bacterianas numa abelha adulta. A composição deste microbioma intestinal é constituída por um conjunto de diferentes componentes bacterianos, sendo esta semelhante ao longo do globo e ainda entre diferentes espécies de abelhas melíferas. O microbioma é dominado por oito espécies de bactérias que promovem o ganho de peso e reduzem a suscetibilidade a agentes patógeneos ao degradar substâncias tóxicas. Algumas destas bactérias, como por exemplo, espécies pertencentes ao género Lactobacillus e Bifidobacillus, têm um papel crucial na imunidade e na defesa contra patógeneos.Como bactérias benéficas, elas foram tomadas como sendo grupos cruciais que são afetados por pesticidas. Além disso, pesticidas podem afetar a saúde dos polinizadores perto de zonas agrícolas. Com o intuito de reduzir a carga de toxicidade e o seu impacto, está a ser desenvolvida uma nova geração de pesticidas biológicos que se acredita serem mais amigos do ambiente. Estes podem ser de origem animal ou vegetal, mas os seus efeitos em insetos ainda não foram profundamente testados. O principal objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da exposição de pesticida no microbioma intestinal de indivíduos adultos da espécie nativa de abelhas melíferas, Apis mellifera ssp. iIberiensis (Engel, 1999), utilizando um fungicida e um bio-inseticida largamente usado em Portugal. Gerou-se a hipótese de que concentrações subletais destes pesticidas iriam afetar a diversidade entre taxa e a abundância geral de os diferentes grupos de bactérias, particularmente aqueles conhecidos como sendo benéficos para a saúde da abelha. A experiência foi realizada com um teste de alimentação crónica de 7 dias de forma a avaliar os efeitos de diferentes concentrações subletais de biocida chamado Cypermethrin (formulação: Sherpa® 100 EC) e um fungicida bem estudado, Difenoconazole (formulação: Cérimonia® 250 EC) e ainda comparar os seus efeitos na mortalidade da abelha, o uptake do pesticida e a composição do microbioma intestinal., Este estudo foi realizado nas instalações da Universidade de Coimbra. A técnica de sequenciação Illumina DNA e a subsequente metabarcoding foram usadas para calcular e definir as alterações no taxa bacteriano. A análise de dados e o teste de significância foi feita usando o software RStudio. Como esperado, a mortalidade não foi afetada pela ingestão do pesticida, já que foram usadas concentrações subletais. O microbioma de abelhas melíferas descoberto, que inclui 38 espécies foi consistente com a literatura já existente. A riqueza específica e a abundância das espécies aumentaram significativamente em abelhas sujeitas à concentração 3 (1/25 of LC50) de ambos os pesticidas, Difenoconazole and Cypermethrin, demostrando perturbações na estrutura da comunidade microbiótica intestinal. Os resultados obtidos em abelhas tratadas com Cypermethrin evidenciam que um aumento na dose do pesticida causa um declínio acentuado no género Raoultella (antes conhecido como Klebsiella). Difenoconazole levou a uma alteração na comunidade microbiótica, principalmente em bactérias de carácter benéfico como Shodgrassela e Bombilactobacillus spp. Os nossos resultados sustêm a necessidade de estudar a influência de pesticidas no microbioma intestinal das abelhas melíferas e promover uma apicultura sustentável.

The western honey bee, Apis mellifera, harbors a largе bacterial communіty іn thе gut, wіth roughly 1 billion bactеrіal cеlls іn a maturе workеr. This gut microbiota composition is known to host a unique set of distinct bacterial components, which is similar across the globe and even between different honey bee species. The microbiome is dominated by eight bacterial species that promote weight gain and reduce pathogen susceptibility by breaking down toxic substances. Some of these bacteria, such as the members of Lactobacillus and Bifidobacillus genus, have been linked to play a crucial role in the immunity and defence against pathogens. As beneficial bacteria, they were hypothesized to be crucial groups that are affected by the pesticides. Furthermore, pesticides are known to affect pollinators' health near agricultural sites. In order to reduce the toxic load and impact, a new generation of biological pesticides, believed to be more eco-friendly, is currently being developed. The main objective of this study was to evaluate the effect of pesticide exposure on the gut microbiome of adult individuals of the native subspecies of honey bees Apis mellifera ssp. iIberiensis (Engel, 1999), testing a fungicide and an insecticide widely used in Portugal., It was hypothesized that sublethal concentrations of these pesticides would affect the diversity between taxa and the overall abundance of different bacterial groups, in particular the ones known to be beneficial to the bee’s health. The experiment was conducted with a 7-day chronic feeding test to evaluate the effects of different sublethal concentrations of a pyrethroid insecticide named Cypermethrin (formulation: Sherpa® 100 EC)) and a well-studied fungicide, Difenoconazole (formulation: Cérimonia® 250 EC) and compared their effects on bee survival and gut-associated microbial composition. The research was done in the facilities of the University of Coimbra. Illumina DNA sequencing technique and subsequent metabarcoding were used to calculate and define the changes in major bacterial taxa. Data analysis and significance tests were performed using the software RStudio.As expected, mortality was not affected by pesticide intake since sublethal concentrations were used. The discovered core microbiome of local honey bees was consistent with the existing literature and included 38 species. Overall richness and abundance of species increased significantly in bees treated with Concentration 3 (1/25 of LC50) of both Difenoconazole and Cypermethrin, showing the disruption of gut community structure. In Cypermethrin treated bees, results showed that an increase in pesticide dose causes a sharp decline in Raoultella (formerly known as Klebsiella). Difenoconazole led to a shift in the microbial community, namely in such beneficial bacteria as Shodgrassela and Bombilactobacillus spp. Our results support the need for further investigating the influence of pesticides on the Honey bee microbiome and promoting sustainable beekeeping.