Mechanisms of antibiotic resistance and virulence in Vibrio spp.

Abstract

Vibrio spp. são autóctones de ambientes aquáticos, encontrando-se vastamente disseminadas no ambiente marinho e estuarino, bem como em sistemas de aquacultura. Algumas espécies de Vibrio têm sido implicadas como agentes causadores de doenças em animais de aquacultura, levando a elevadas perdas monetárias e taxas de mortalidade. As estirpes patogénicas possuem um vasto manancial de fatores de virulência. Embora espécies de Vibrio sejam geralmente suscetíveis à maioria dos antibióticos de uso humano e veterinário, o uso excessivo de antibióticos em hospitais, agricultura e aquacultura levou a um aumento dos níveis da resistência nas espécies deste género. O objetivo deste estudo foi avaliar o possível risco para a saúde humana e animal que espécies de Vibrio do estuário da Ria de Aveiro representam. Foi analisada uma coleção de 77 isolados, pertencentes a 11 espécies, previamente obtidos em três campanhas diferentes (Outono, Primavera e Verão) em 26 locais do estuário. A análise de BOX-PCR revelou que os isolados são geneticamente diversos, possivelmente devido à adaptação a condições ambienteis variáveis (e.g. pH, temperatura e salinidade) ao longo do estuário. Os isolados de Vibrio da coleção são halotolerantes, com 45% a crescer em meio de cultura suplementado com 7.5% de NaCl. A tolerância ao sal entre os isolados não parece depender dos locais de amostragem ou estação do ano. A suscetibilidade a 8 antibióticos foi avaliada através da análise de 8 compostos e os isolados foram sensíveis à maioria deles, com exceção da amoxicilina para a qual 78% dos isolados apresentaram resistência. Os perfis de resistência a antibióticos não parecem estar associados a locais de amostragem ou espécie. A presença de genes que codificam as β-lactamases TEM, SHV e CTX-M, bem como determinantes de resistência associados a quinolonas (qnrVC e qnrA) e genes de resistência à tetraciclina (tetA, B, C, D, E e M) foi avaliada. Quatro (5%), nove (11%) e um (2%) isolados possuíam qnrVC, blaTEM e tetB, respetivamente. blaSHV, blaCTX-M, qnrA e tetA, C, D, E e M não foram detetados. Cinquenta e quatro (70%) dos isolados continham plasmídeos de vários tamanhos, com 6 (7%) deles contendo genes de resistência a antibióticos, enquanto que nenhum integrão de classe 1, 2 e 3 foi detetado. A prevalência de genes associados à virulência (chiA, vhpA, luxR, flaC, hlyA, tlh,e toxRVC) também foi avaliada. Notavelmente, chiA, luxR e tlh foram detetados em mais de 50% dos isolados, tendo toxRVC e hlyA sido detetados exclusivamente em V. cholerae. A produção de atividades extracelulares também foi avaliada. Amilase, DNase, lipase e caseinase foram as atividades mais detetadas. Isolados pertencentes a V. parahaemolyticus, V. diabolicus e V. alginolyticus apresentaram mais atividades extracelulares, enquanto que isolados pertencentes a V. mytili e V. mediterranei não apresentaram nenhuma das atividades pesquisadas. Com base na presença de fatores de virulência e perfis de resistência a antibióticos, 14 isolados de Vibrio foram selecionados para avaliar a capacidade de formação de biofilme com duas salinidades diferentes: 1% NaCl e 2.5% NaCl. V. cholerae foi consistentemente um produtor de biofilme em ambas as salinidades, enquanto que V. campbellii produziu biofilme a 1% NaCl. Assim, este trabalho contribuiu para o conhecimento das características de virulência e suscetibilidade a antibióticos de estirpes estuarinas de Vibrio. Estes resultados reforçam a necessidade de estudar e monitorizar rotineiramente a resistência a antibióticos e características de virulência que se podem dispersar no estuário.

Vibrio spp. are autochthonous to aquatic environments, being widely distributed in marine and estuarine environments, as well as in aquaculture systems. Some Vibrio species are known to cause infections in aquaculture animals, leading to high monetary losses and mortality rates. Pathogenic strains possess an array of virulence factors. Although Vibrio are usually susceptible to most antibiotics of human and veterinary use, the overuse of antibiotics in hospital, agriculture, and aquaculture settings, led to an increase of antibiotic resistance levels among species of this genus. The aim of this study was to assess the possible risk to human and animal health that Vibrio species from the estuary Ria de Aveiro represent. A collection of 77 isolates, belonging to 11 species, previously obtained in three different campaigns (Autumn, Spring, and Summer) from 26 sites in the estuary was analyzed. BOX-PCR analysis revealed that the isolates are genetically diverse, possibly reflecting adaptation to variable environmental conditions (e.g., pH, temperature, and salinity) along the estuary. Vibrio isolates in the collection are halotolerant, with 45% growing at 7.5% NaCl. Tolerance to salt among isolates did not depend on sampling sites or season. Antibiotic susceptibility was evaluated against 8 compounds and isolates were susceptible to most of them, except to amoxicillin to which 78% of the isolates showed resistance. Antibiotic resistance profiles were not correlated with sampling season or species. The presence of genes encoding β-lactamases TEM, SHV, and CTX-M, quinolone-associated resistance determinants (qnrVC and qnrA), and tetracycline resistance genes (tetA, B, C, D, E, and M) was inspected. Four (5%), nine (11%), and one (2%) isolates harbored qnrVC, blaTEM, and tetB, respectively. blaSHV, blaCTX-M, qnrA, and tetA, C, D, E, and M were not detected. Fifty-four (70%) of the isolates harbored plasmids from various sizes, with 6 (7%) of them also containing ARGs, while no class 1, 2, and 3 integrons were detected. The prevalence of virulence-associated genes (chiA, vhpA, luxR, flaC, hlyA, tlh, and toxRVC) was also determined. Notably, chiA, luxR, and tlh were detected in more than 50% of the isolates, with toxRVC and hlyA being detected exclusively in V. cholerae. Production of extracellular activities was also evaluated. Amylase, DNase, lipase, and caseinase were the activities more frequently detected. Isolates affiliated with V. parahaemolyticus, V. diabolicus, and V. alginolyticus showed more extracellular activities, while those affiliated with V. mytili and V. mediterranei presented no extracellular activity. Based on the presence of virulence factors and antibiotic resistance profiles, 14 Vibrio isolates were selected to assess biofilm formation capability at two different salinities: 1% NaCl and 2.5% NaCl. V. cholerae was consistently a biofilm producer at both salinities, while V. campbellii produced biofilms at 1% NaCl. Thus, this work contributed to the knowledge of virulence characteristics and susceptibility to antibiotics of estuarine Vibrio strains. These results reinforce the need to study and routinely monitor antibiotic resistance and virulence traits of environmental isolates that may disperse among other strains in the estuary.